לימוד גיל תלויי חוסר יציבות הגנום באמצעות ס cerevisiae דגם כרונולוגי תוחלת חיים

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לחקור חוסר יציבות גנומית תלוית-גיל בשמרים, באמצעות שילוב של תוחלת חיים כרונולוגית עם קבוצה של בדיקות פשוטות לנזקי DNA ומוטציות. דבר זה מושג תחילה על ידי דגימה של תרביות הזדקנות כרונולוגית מדי יומיים ובדיקת חיות באמצעות ספירת יחידות יוצרות מושבות או CFU. השלב הבא בפרוצדורה הוא בחינת מוטציות ב-DNA על ידי דגימת תרביות מזדקנות וזריעת תאים על מצע ברירה ספציפי למוטציות.

בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות שינויים במוטציות של DNA במהלך הזדקנות כרונולוגית של שמרים, באמצעות נורמליזציה של תוצאות בדיקת המוטציות ביחס לחיוניות. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום ההזדקנות, כגון המנגנונים הקושרים בין הזדקנות לאי-יציבות גנומית. כדי לבצע בדיקה של תוחלת חיים כרונולוגית של שמרים או CLS, ראשית יש להחדיר מושבה בודדת של שמרים לתוך מילליטר אחד של תווך גלוקוז סינתטי מלא, או תווך SDC, ולהדגיר למשך לילה עם ניעור בטמפרטורה של 30 °C. למחרת, יש לדלל את תרבית הלילה לתוך 10 מיליליטר של תווך SDC טרי עד ל-OD 600 של 0.05 עד 0.1, ולהדגיר עם ניעור בטמפרטורה של 30 °C למשך שלושה ימים.

ביום השלישי, כאשר התאים נמצאים בשלב התחנה (stationary phase), דללו כל דגימה של Eloqua פי 10,000 במים שעברו אוטוקלאב, לאחר מכן הוציאו שני מנות (aliquots) של 10 µL מהבקבוק והעבירו 10 µL מכל תרבית מדוללת לצלחת A-Y-E-P-D. הדגרירו את הצלחת בטמפרטורה של 30 °C עד להופעת מושבות. מספר המושבות שהופיעו או יחידות יוצרות מושבות (CFU) מהתרבית של היום השלישי ייחשבו כ-100% הישרדות.

המשיכו להוציא אליקוטיות מהתרבית המזדקנת בימים הבאים לצורך זריעה. התאימו את גורמי הדילול בהתאם כדי להבטיח קבלת כ-20 עד 100 מושבות בבדיקת ה-CFU. את הדגימה מפסיקים כאשר חיוניות התרבית יורדת מתחת ל-1% (בדרך כלל בין הימים 11 ל-13); ניתן לבחון את חיוניות התאים גם בתאים שהזדקנו על צלחות.

כדי להתחיל במבחן זה, יש להחדיר מושבה בודדת לתוך מיליליטר אחד של מצע גלוקוז סינטטי מלא (synthetic complete glucose medium), ולדגרה למשך לילה עם ניעור בטמפרטורה של 30 °C. כאשר התרבית תגיע לצפיפות של כ-10⁸ תאים למיליליטר, יש לדלל את התרבית במים שעברו אוטוקלאב לריכוזים של 100 עד 200 תאים ל-10 µL ו-1000 תאים ל-10 µL. עבור כל זן, יש להכין סט של 8 עד 20 צלחות SDC ללא טריפטופאן, המסומנות בהתאם לצפיפות הזריעה.

כדי להבטיח שניתן יהיה לספור בין 10 ל-100 מושבות, ובצפייה לירידה בחיוניות במהלך ההזדקנות, פזרו שתי מנות של 10 עד 30 µL של תרבית מדוללת על כל צלחת. דגרו את סט הצלחות בטמפרטורה של 30 °C למשך משך ניתוח אורך החיים; ביום הזריעה ובכל יומיים לאחר מכן, הוציאו צלחת אחת והוסיפו בטיפות 0.5 mL של trytophan כדי לאפשר לתאים חיוניים לגדול. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 30 °C למשך 48 עד 72 שעות נוספות.

לאחר 48 עד 72 שעות, ספרו את ה-CFU לבדיקת החיוניות ביום הוספת הטריפטופן, כדי לבחון נזק ל-DNA ותדירות מוטציות במהלך הזדקנות כרונולוגית. מספר זנים בעלי תכונות מיוחדות גודלים במקביל עם זן הבר (wild type) עבור בדיקת CLS של השמרים.

ניתן להעריך את תדירות המוטציות הספונטניות על ידי מדידת תדירות העמידות ל-L-Canavanine בתרבית המזדקנת כרונולוגית. מוטציות בגן can1, המקודד עבור פרמיאז ארגינין של הפלזמה, הופכות את התאים לעמידים לאנלוג של ארגינין, L-Canavanine. תאים העמידים ל-L-Canavanine יגדלו על מצעים סינתטיים מלאים עם השמטת ארגינין, המועשרו ב-L-Canavanine sulfate. מדידה של תדירות רברסיה חיובית של trip, בזן המכיל מוטציית amber ברצף המקודד של trip1, מאפשרת להעריך את קצב החלפת הבסיסים במהלך הזדקנות כרונולוגית של שמרים.

תאי רורסיה (reversion) חיוביים יגדלו על מצעים דלילי טריפטופאן. זן הליזה השלילי EH1-50 נושא הסטה של +4 במסגרת הקריאה הפתוחה, הגורמת לאטרופיה של lysine, וניתן להפוך זאת על ידי מוטציות של הכנסה או מחיקה קטנה. הרורסנטים ייבחרו על מצעים דלילי lysine כדי לזהות ארגון מחדש גס של הכרומוזומים או gcr.

נעשה שימוש במאבב מוטנטי שבו HX T 13, הממוקם במרחק של 7.5 kilobases מהקצה הטלומרי של can one בכרומוזום חמישה, משובש על ידי קסטת U three. מוטציות בשני הגנים can one ו-U three הופכות את התאים לעמידים ל-L Canavan ול-five fluoro orotic acid, בהתאמה. מכיוון שתדירות מוטציות נקודתיות המתרחשות בשני הגנים היא נמוכה, ניתוח של תדירות העמידות הן ל-El Canavan והן ל-five fluoro orotic acid מספק הערכה של gcr לצורך ניטור רמת הרקומינציה ההומולוגית והבלתי-הומולוגית. במהלך ההזדקנות הכרונולוגית נוצרים מוטנטים הנושאים חזרות הפוכות בעלות הומולוגיה של 100% או 91%.

ה-IRS ב-locus של his3 מאפשר, באמצעות רקומבינציה בין ה-IRS, ביטוי של חלבון his3 פונקציונלי. לפיכך, תאים שבהם התרחשה רקומבינציה יגדלו על מצעי histidine dropout שנוספו להם גלקטוז. ביום השלישי, כאשר התאים נמצאים בשלב סטציונרי, תסיר כמות מתאימה של תאים מכל תרבית הזקנה.

כיוון שאותו הליך משמש לכל הבדיקות, יעובד דגימה אחת בלבד. לצורך סרטון זה, יש להשקיע את התאים על ידי סבוב במ centri-fuge שולחני. הסר את הנוזל העליון (supernatant) ושחזר את התאים במיליליטר אחד של מי-אוטוקלאב.

שוב, הסירו את הנוזל העליון וסספנדו מחדש את משקע התאים ב-100 µL של מים; פזרו את התאים על הפלטות המתאימות כדי לבחור את הרברטנטים (reverts) הרצויים. דגרו את הפלטות ב-30 °C, ולאחר שלושה עד ארבעה ימים ספרו את ה-CFUs; תדירות המוטציה מנורמלת למספר התאים החיוניים. גרף זה מציג תוצאות מייצגות מבדיקת תוחלת חיים כרונולוגית טיפוסית, כאשר הישרדות כרונולוגית של תאי wildtype מושווית לזו של מוטנטים מסוג S CH nine delta TOR one delta ו-RAs two delta.

בתרבית נוזלית, מוטנטים החסרים את TOR one s, CH nine או RAs two מראים תוחלת חיים כרונולוגית מוארכת. יתרה מכך, חסרים ב-s CH nine וב-RAs two מראים אפקט מצטבר על קידום אריכות הימים והישרדות כרונולוגית בנוכחות מקורות פחמן שונים. שימוש בבדיקת חיוניות NC two מוצג בגרף הבא.

ביום הראשון, תרביות של SDC מסוג פרא (wild type) דוללו ונזרעו על מצעי SC trip dropout ללא מקור פחמן. מצעי SC Tripp dropout שהוספו להם גלוקוז, אתנול או גליצרול (orates plates) דגרו בטמפרטורה של 30 °C מדי יומיים. מכל סט נלקח מצע אחד, ואליו הוספו חומרי תזונה מתאימים כדי לאפשר צמיחה ויצירת מושבות.

שכיחות מוטציות התלויה בגיל משתנה מאוד בהתאם לזן, לרקע, למניפולציה גנטית, לתרבית, לתנאים ולגיל. טבלה זו מציגה תוצאות טיפוסיות שהתקבלו בזן מסוג בר (wild type). תוצאות מייצגות של סינתזת מעקף נגעים (trans lesion synthesis) מוצגות בתמונה הבאה.

העלייה בתדירות המוטציות התלויה בגיל עשויה לכלול שינויים בתיקון DNA שגוי תוך שימוש בתמציות גרעיניות ובתבניות DNA שונות. ניתן להעריך את הסינתזה הטרנסלטיבית או TLS בתאים מזדקנים כרונולוגית. נותחו תמציות גרעיניות מתאי מסוג wild type ומתאי מוטנט SCH nine delta, שנמצאים בשלב סטציונרי בגיל שלושה ימים.

מוצרי TLS עם תבנית לא פגועה מסומנים בקוים רציפים ומוצרי TLS עם תבנית פגועה מסומנים בקוים מקווקווים. לא נצפתה סינתזה חוצת נגע (trans lesion synthesis) בתמציות גרעיניות של המוטנט s CH nine delta ארוך החיים; פריימרים חופשיים מסומנים בחץ פתוח. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של אופן ביצוע ניתוח אורך חיים כרונולוגי וניתוח מוטציות ב-DNA בשמרים.