באמצעות מכשירים microfluidic למדוד פנוטיפים תוחלת החיים סלולר בתאי שמרים ניצני יחיד
30 במרץ 2017
מאמר זה מציג פרוטוקול מותאם לייצור שבבי microfluidic ואת ההתקנה של ניסויים microfluidic כדי למדוד את אורך החיים פנוטיפים הסלולר של תאי שמרים בודד.
המטרה הכוללת של ניסוי זה היא ליצור מכשיר מיקרופלואידיקה מיוחד ולהשתמש בו כדי למדוד את תוחלת החיים והפנוטיפים התאיים של תא שמרים בודד. שיטה זו יכולה לעזור לענות על כמה משאלות המפתח בתחום הזדקנות השמרים, כגון מדוע תאי אם מזדקנים ומתים ומהם האירועים המולקולריים המוקדמים יותר המניעים את אובדן ההומאוסטזיס התאי ובסופו של דבר הזדקנות התאים ומוותם? היתרון העיקרי של השיטה הזו הוא שאנו יכולים לעקוב אחר תאי אם, לעקוב אחר תוחלת החיים שלהם והסמנים המולקולריים השונים בו זמנית, כך שנוכל לחפש אירועים מולקולריים שקשורים לתוחלת החיים.
למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנה לגבי הזדקנות שמרים, ניתן ליישם אותה גם בתחומים אחרים, כגון ניטור תגובות משניות להשתתפות הדורשת בדיקת תאים במשך דורות רבים. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שייצור מכשירים מיקרופלואידיים, העמסת תאים, הגדרת מיקרוסקופ דורשים תרגול רב כדי לבצע בהצלחה. הדגמה מוקדמת של שיטה זו היא קריטית מכיוון שקשה להעמיס כראוי את המכשיר המיקרופלואידי בשמרים.
כדי להתחיל לייצר תבנית פרוסות סיליקון למכשיר בטכניקות סטנדרטיות כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. מניחים אותו עם הצד כלפי מעלה לתוך צלחת פטרי בגודל 15 סנטימטר. אבטח את התבנית על צלחת הפטרי בעזרת קלטות.
לאחר מכן הניחו סירת שקילה נקייה על משקל וקרעו את האיזון. יוצקים 50 גרם של בסיס PDMS לתוך סירת השקילה ולאחר מכן מוסיפים חמישה גרם של חומר ריפוי PDMS. מערבבים את בסיס ה-PDMS וחומר הריפוי בעזרת פיפטה חד פעמית.
התחל מקצה סירת השקילה ונע לאט פנימה. ערבבו היטב את התערובת במשך מספר דקות, עד שנוצרות בועות קטנות בכל התערובת. יוצקים את התערובת לאט לתוך צלחת הפטרי, כך שהיא מכסה לחלוטין את תבנית פרוסות הסיליקון.
לאחר מכן מניחים את צלחת הפטרי בוואקום למשך 10 דקות כדי להסיר את כל בועות האוויר מתערובת ה-PDMS. אם נשארות בועות על פני התערובת, לאחר הוצאתן מהוואקום, השתמש בפיפטה כדי לפוצץ אותן. לאחר מכן, אופים את המכשיר בחום של 75 מעלות צלזיוס למשך שעתיים.
כאשר מקוררים בחזרה לטמפרטורת החדר, חותכים בזהירות את ה-PDMS סביב התבנית ולאחר מכן מקלפים בעדינות את שכבת ה-PDMS הפולימרי מתבנית פרוסות הסיליקון, תוך הימנעות מכל נזק לבניית תבנית הוופל. הנח את שכבת ה-PDMS על הספסל כשצד התבנית פונה כלפי מעלה. חתוך בזהירות את השבב הבודד עם סכין גילוח תעשייתי בקצה אחד, תוך שמירה על מרווח הולם מהקצה של כל שבב בודד כדי למנוע נזקי בנייה.
כשצד התבנית פונה כלפי מעלה, השתמש בעט ניקוב כדי לנקב חורים ישר כלפי מטה דרך עיגולי הכניסה והיציאה בכל צד של התעלות. בדוק כל חור על ידי הכנסת מחט עט האגרוף שוב לתוך החור. ודא שהמחט יכולה לצאת מהצד השני, מה שמעיד על כך שאין חסימות.
לאחר מכן, השתמש בסרט כדי לנקות חלקיקי אבק ופסולת מהמשטח העליון. חזור על שלב זה לפחות שלוש פעמים, והשאיר חתיכת סקוטש נקייה על ה-PDMS כדי לשמור על משטח נקי מאבק. לאחר מכן הפוך את המכשיר וחזור על הליך זה באתר הנגדי של ה- PDMS.
השאירו את פיסת הסרט האחרונה גם בצד זה. כעת הכינו משטח זכוכית לבסיס המכשיר. בחר את חתיכת זכוכית הכיסוי בגודל 24 מילימטר על 30 מילימטר בעובי שבין 13 ל -17 מילימטרים.
יש לרסס אתנול 70% על הזכוכית, ולייבש אותה עם מסיר אבק כדי לעקר את פני השטח. לאחר מכן העבירו את זכוכית הכיסוי וה-PDMS לצלחת פלסטיק. הסר את הסקוטש מה-PDMS, והנח את צד התבנית כלפי מעלה בצלחת, מבלי לגעת במשטח העליון.
לאחר מכן העבירו את הצלחת לתא פלזמה. החל טיפול בפלזמת חמצן על ה-PDMS ועל זכוכית הכיסוי כדי להפוך את המשטחים להידרופילים. לאחר מכן הסר את הצלחת מתא הפלזמה וחבר בזהירות את המשטחים המטופלים בפלזמה של ה-PDMS בזכוכית כיסוי.
ודא שאין בועות אוויר בין ה-PDMS לזכוכית הכיסוי. לבסוף, מעבירים את המכשיר לתנור ואופים בחום של 75 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות. טבלו את צינורות הקלט והפלט בתמיסת אתנול של 70% יום אחד לפני הכנת שבב PDMS.
למחרת מלאו מזרק של חמישה מיליליטר במים שעברו חיטוי, ושטפו כל צינור על ידי הנחת הצינור על המזרק ושטיפת הצינור במים. חזור על שלב הכביסה לפחות שלוש פעמים כדי להסיר שאריות אתנול. לאחר מכן בחן את ערוצי ה-PDMS תחת מיקרוסקופ אופטי.
באמצעות מטרה של פי 10 ודא שהמבנים עקביים ושלמים. ייצב את שבב ה- PDMS השלם על פלטפורמת המיקרוסקופ באמצעות סקוטש טייפ. אבטח מזרק של חמישה מיליליטר עמוס במים סטריליים למשאבת מזרק והכנס את צינורות הקלט והפלט המתאימים למכשיר.
הגדר את קצב הזרימה ל-750 מיקרוליטר לשעה ושטוף את השבב למשך כ-10 דקות. צפה בערוצים כדי לוודא שכל בועות האוויר נשטפות. אם נותרו בועות כלשהן לאחר שטיפה של 10 דקות, כוונן ידנית את המהירות כדי לחסל את הבועות.
העבירו מיליליטר אחד של דגימת שמרים מוכנה לשני צינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר וצנטריפוגה את הדגימות למשך חמש דקות ב-3,000 פעמים G.הסר את רוב הסופרנטנט מכל צינור ושלב את השאר ליצירת דגימה של 5 מיליליטר. כאשר דגימת השמרים מוכנה כעת, הסר את צינורות הקלט משבב ה-PDMS. הפוך ידנית את משאבת המזרק כדי לשאוב בועת אוויר קטנה באורך של סנטימטר עד שני סנטימטרים, כל צינור קלט, ולאחר מכן לשאוב תרביות תאים.
לאחר מכן הכנס את צינור הקלט בחזרה לשבב ה-PDMS והפעל מחדש את המשאבה כדי לטעון את התאים במהירות של 750 מיקרוליטר לשעה. השאר את משאבת המזרק דולקת למשך 10 דקות ולאחר מכן בדוק את התקדמות העמסת התאים במיקרוסקופ. טעינה מוצלחת תלכוד תאים מתחת ליותר מ-60% מעמוד התלייה.
כדי לשמור על תאי השמרים, העבירו את התמיסה במזרק לתמיסת תזונה, והתאימו את המהירות ל -400 מיקרוליטר לשעה. ניתן לקבל את הפנוטיפ של תוחלת החיים של שמרים על ידי ספירת מספר הניצנים המיוצרים על ידי כל תא אם לכוד, והערכת אומדן קפלן-מאייר. באמצעות פרוטוקול זה, המכשיר לוכד לעתים קרובות תאי בת טריים שנבטו מהתאים הלכודים כבר.
תאים אלה הופכים לאחר מכן לתאי אם טריים שניתן לזהות באמצעות תוכנת ניתוח תמונה במורד הזרם. תאי האם הטריים הללו מספקים מדידת תוחלת חיים מדויקת יותר. בניסוי זה, תוחלת החיים הממוצעת של תאי האם הטריים הייתה מעט ארוכה יותר בכשני דורות.
בנוסף למספר הניצנים, ניתן לחלץ מנתוני ההדמיה את מרווח הזמן בין שני אירועי ניצנים עוקבים. הנביטה מואטת באופן דרמטי לקראת סוף תוחלת החיים שלהם, מה שמעיד על מצבם הלא בריא של תאים מזדקנים אלה. בזמן ניסיון הליך זה, חשוב לזכור גם להשתמש בשבב טרי כדי לסייע במניעת בועות, וגם להגדיל את ריכוז התאים על מנת לשפר את יעילות העמסת התאים בעת הצורך.
לאחר פיתוחה, טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הזדקנות השמרים לחקור את השינויים המולקולריים המוקדמים שהם סיבתיים לפנוטיפ ההזדקנות. לאחר צפייה בסרטון זה אתה אמור להבין היטב כיצד לייצר את המכשיר המיקרופלואידי הזה וכיצד להשתמש בו כדי למדוד תוחלת חיים ופנוטיפים תאיים בתאים בודדים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול ליצירת התקני מיקרופלואידיקה ייעודיים למדידת תוחלת החיים והפנוטיפים התאיים של תאי שמרים בודדים. שיטה זו נועדה לתת מענה לשאלות מפתח בתחום הזקנה של השמרים, ובמיוחד בנוגע לתהליכי ההזדקנות של תאי האם.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מיקרופלואידיקה
- ביולוגיה תאית
- הזדקנות שמרים
רקע
- התקנים מיקרופלואידיים מאפשרים בקרה מדויקת על הסביבה התאית.
- הבנת הזקנה בשמרים עשויה לספק תובנות לגבי תהליכי הזדקנות ביולוגיים רחבים יותר.
- מעקב אחר תאי אם והסמנים המולקולריים שלהם הוא קריטי למחקר זה.
- הטענה נכונה של שמרים לתוך התקנים מיקרופלואידיים היא מאתגרת ודורשת תרגול.
מטרת המחקר
- למדידת תוחלת החיים של תאי שמרים בודדים.
- לחקר האירועים המולקולריים המובילים להזדקנות תאית.
- לבחינת המתאם בין תוחלת החיים למספר סממנים מולקולריים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ייצור של התקנים מיקרופלואידיים.
- הטענת תאי שמרים אל תוך ההתקנים.
- הגדרת המיקרוסקופ לצורך תצפית.
- מעקב אחר פנוטיפים תאיים ואורך חיים.
תוצאות עיקריות
- מעקב מוצלח אחר תאי אם ואורך חייהם.
- זיהוי סמנים מולקולריים הקשורים להזדקנות.
- תובנות לגבי תהליך ההזדקנות של תאי שמרים.
- יישומים פוטנציאליים בתחומים אחרים של מחקר תאי.
מסקנות
- השיטה המיקרופלואידית מספקת תובנות בעלות ערך לגבי הזדקנות של שמרים.
- ניתן להתגבר על אתגרים בייצור המכשיר ובהטענת התאים באמצעות תרגול.
- טכניקה זו עשויה להיות ישימה לתחומי מחקר אחרים הדורשים תצפית תאית לטווח ארוך.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
גישה מיקרופלואידית זו מאפשרת מעקב אורך רב-רזולוציה של דינמיקת הזדקקות של תאים בודדים, ומספקת תובנות מכניסטיות לגבי אובדן ההומיאוסטזיס התאי שיכולות לסייע בתיקוף מטרות במסלולים הקשורים להזדקנות. באמצעות קורלציה בין סמנים מולקולריים לתוצאות תוחלת חיים בסביבה מיקרוסקופית מבוקרת, השיטה תומכת בביטחון חיזוי בבדיקת השערות בשלב מוקדם עבור מנגנוני אריכות חיים שמורים. היכולת להרחבת השיטה על פני זנים ותנאים שונים ממצבת אותה כפלטפורמת גילוי רב-פעמית להפחתת סיכונים במטרות טיפוליות במחלות הקשורות לגיל.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי קישור אירועים מולקולריים לפנוטיפים של הזדקנות תפקודית בתאים בודדים.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות קורלציה בזמן אמת בין סמנים ביולוגיים למסלולי תוחלת חיים.
- ערך מדעי: מגביר את הוודאות לגבי המטרה על ידי זיהוי מניעים מולקולריים שמורים של הזדקנות על פני רקעים גנטיים שונים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: הכנה של מערכות ביולוגיות סטנדרטיות ו可שחזרות לסריקה פנוטיפית כמותית בעبر ערוצים מרובים.
- ערך תפעולי: אספקת דימויים ברזולוציה גבוהה ומדידות של תדירות ניצות המאפשרות הערכה מהימנה של השפעת תרכובות.
- ערך מדעי: מקל על הניתנות להרחבה של הבדיקה (scalability) על ידי לכידת מאות תאים לכל ערוץ לצורך ניתוח אורכי.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מספק תובנות על מערכות רלוונטיות למחלה באמצעות אפיון דינמיקת ההזדקנות התאית ברזולוציה של תא בודד.
- ערך תפעולי: מבטיח המשכיות תרגומית משלב הגילוי דרך מדידה סטנדרטית של תוחלת חיים ופנוטיפ.
- ערך מדעי: תומך בהפחתת סיכונים מכניסטים על ידי הבחנה בין אירועים מולקולריים סיבתיים לבין שינויים קורלטיביים בהזדקנות.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של שלבי הגילוי המוקדמים על ידי אפשור מחקר על הזדקנות המונחה-השערה, המנחה את זיהוי המולקולות המובילות (leads) באמצעות עיגון פנוטיפי של מטרות מולקולריות.
- ביולוגיה של גילוי: תומכת בהבהרת מסלולים ביולוגיים על ידי מעקב אחר סממנים מולקולריים בזמן אמת לצד תוחלת החיים השכפולית בתאי אם.
- סריקה: מספקת פלטים פנוטיפיים כמותיים ופתורים בזמן, כגון מרווחי ניבוב ושינויים מורפולוגיים, לצורך סריקת תרכובות.
- אנליזה: מייצרת הערכות הישרדות לפי קפלן-מאייר ונתוני שושלת של תא בודד כדי לאפשר ניתוח השוואתי של תנאים.
- מחקר תרגומי: מתחברת להמשכיות פרה-קלינית על ידי אספקת פנוטיפי הזדקנות שמורים הניתנים לתרגום למודלים אוקריוטיים גבוהים יותר.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כפלטפורמה מודולרית הניתנת להתאמה למספר זנאי שמרים ותנאים סביבתיים לשימוש חוזר.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי על ידי הפחתת העמימות בקישור בין סממנים מולקולריים לתוצאות הזדקנות.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים לייצור מכשירים ולהטענת תאים.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של המשך או הפסקה (go/no-go) על ידי מתן אפשרות לזיהוי מוקדם של התערבויות לא יעילות במסלולי הזדקנות.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים באמצעות זיהוי מטרות בעלות תיקוף פנוטיפי חזק במודלים של הזדקנות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בייצור מכשירים מיקרופלואידיים וטיפול סטרילי במולקולות ביולוגיות.
- תלוי בגישה למערכות טיפול בפלזמה, משאבות מזרק ומערכי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית להכנה עקבית של השבבים ולטיפול בזני שמרים.
- כולל שיקולי התאמה בעת הרחבה למערכות מודל שאינן שמרים, בשל הבדלים בגודל התא ובקישור (adhesion).
- מוגבל על ידי הצורך בהסרה קפדנית של בועות ובניקוי פני השטח כדי להבטיח לכידת תאים ודימות אמינים.
