ויזואליזציה של דנ"א רקומביננטי ו קומפלקסים חלבונים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי
18 ביולי 2011
כוח הקשה במצב מיקרוסקופ אטומי (AFM) שיטת הדמיה של פלסמיד דנ"א, חלבונים cytoplasmic, ו-DNA-חלבון מתחמי מתואר. השיטה כוללת גישות חלופיות להכנת דגימות הדמיה AFM בעקבות מניפולציה ביוכימית. ה-DNA המכיל אזורים ספציפיים אינטראקציה חלבון שנצפה כמעט פיזיולוגי התנאים חיץ.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא הדמיה של ביו-מולקולות כגון DNA וחלבונים בבפפרים מימיים בזמן אמת באמצעות מיקרוסקופיית כוח אטומי. דבר זה מושג תחילה על ידי הכנת הביו-מולקולות להדמיה. לאחר מכן, המיקרוסקופ כוח האטומי מוגדר וגשש קנטילבר FM ממוקם.
לאחר מכן, פני הדגימה והביומולקולות הרלוונטיות מדומיינות ומנותחות. בסופו של דבר, ניתן להפיק תוצאות המראות את הגודל הכללי, הכמות והארגון של DNA וחלבונים, וכן קומפלקסים ביומולקולריים הטרוגניים בתנאים של תמיסות חוצץ באמצעות מיקרוסקופיה של כוח אטומי. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום המלווים המולקולריים (molecular chaperones), כגון מהי הגיאומטריה הסטריאוכימית של קומפלקס המלווים והמלווים-המסייעים (cos chaperones) ביחס למולקולת המטרה.
הדגמה חזותית של שיטה זו היא מועילה, שכן שלבי הכנת ה-AFM והגשושית של Kent lever עשויים להיות קשים ללמידה מהוראות מודפסות, בעיקר בשל המורכבויות הכרוכות במניפולציה הפיזית שלהם. את הפרוצדורה ידגימו מורגן שאנון וג'ון גרץ, שני סטודנטים מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, יש לבודד את מולקולות החלבון או ה-DNA שיוצגו וניתן אותם בתמיסת באפר מימית. לאחר אישור טוהר הדגימה, יש לדגרה בבאפר ספיחה ל-AFM על קרח כדי לעודד את היצמדות הדגימה למיקה.
עבור דגימות חלבון, השתמש ב-10 millimolar heaps buffer. עבור DNA, בופר המכיל מגנזיום המורכב מ-10 millimolar tris, pH 7.5, 10 millimolar sodium chloride ו-2 millimolar magnesium chloride מתאים להרכבת גשש ה-AFM. הנח את מחזיק הגשש של תא הנוזל על תחנת העגינה המתאימה להתקנת הקנטילבר.
אתר את הקנטילבר הארוך והעבה של גשש מנוף ניטריד חד למטרות הדימות. העבר אותו בזהירות למחזיק הגששים של תא הנוזלים, תוך הקפדה שהחוד יישאר במצב אנכי. לאחר מכן, בחן את הקנטילבר תחת מיקרוסקופ אור כדי לוודא שהוא שלם ומוצב כראוי במחזיק הגששים של תא הנוזלים.
לאחר מכן, הסר בזהירות את ראש ה-a FM ממכלול הזנב של המכשיר על ידי הידוק בורג תפס הראש העצבי. הפוך את ראש ה-a FM והדחף בחוזקה את מחזיק הפרובה של תא הנוזל אל ארבעת הפינים בבסיס ראש ה-a FM. לבסוף, החזר בזהירות את ראש ה-a FM אל מכלול הזנב של המכשיר.
כדי להכין את ה-FM לפני דימוג הדגימות, סובב את הכפתורים של מיקרוסקופ האור המובנה כדי לאתר את קצה הקנטילבר, וכוון את חיצי המעלה והמטה של בקר האופטיקה בתוכנה כדי להביא את קצה הקנטילבר לפוקוס. השתמש בכפתורי כיוון הלייזר כדי ליישר את הלייזר לקצה הקנטילבר. זהו אחד השלבים המאתגרים ביותר מבחינה טכנית בפרוטוקול; המיקום מבוצע ידנית ודורש כיוון מדויק של הכפתורים.
ניטור זהיר של הלייזר בנקודת ההחזרה ובנקודת ההארה מעלה את הסיכוי ליישור מוצלח. לאחר מכן, כווננו את כפתורי הגלגלת של הגלאי הפוטואלקטרי בראש ה-AFM כדי למרכז את הגלאי הפוטואלקטרי. הניחו לוחית MICA ששובשה לאחרונה ומחוברת לדיסק דגימה מתכתי של AFM על תפס הדגימה הממוגנט שמעל ללוחית תמיכת ה-AFM.
סובב את לוחית התמיכה של ה-a FM כך שדיסק הדגימה ימוקם לצילום הראשוני. השתמש בבקרת מיקוד המשטח של תוכנת המכשיר כדי להוריד את ראש ה-a FM לעבר פניו של דיסק דגימת ה-MICA. בחר בסמל הכיוונון (tune) מתוכנת המכשיר וכוונן את הקנטילבר, עד שמאפיינים בולטים על פני השטח של ה-MICA או השתקפות החוד יהיו במיקוד.
תדר התהודה של גששי MSNL או SNL מומלצים הוא 20 עד 60 kilohertz. בחרו ב-5% peak offset כדי לדמות את דגימת ה-MICA. ראשית, הצמידו את הגשש לפני השטח של ה-MICA, הגדירו גודל סריקה ראשוני של 10 micrometers וקצב סריקה של one hertz.
בצעו סריקה מלאה של שדה ברוחב 10 מיקרומטר ותעו את התמונות. לאחר מכן, הקטינו את גודל הסריקה ל-5 ו-0.5 מיקרומטר ותעו תמונות מלאות של כל שדה. נתקו את הגשש על ידי לחיצה אחת על סמל הניתוק בתוכנת המכשיר.
כדי לדמיין את הביומולקולות הרלוונטיות, ערבבו 5 µL מהדגימה שהוכנה עם 45 µL של בופר ספיגה טרי. הוסיפו בזהירות 50 µL מהתמיסה המכילה ביומולקולות בריכוז 0.5 µg/mL ישירות על פני השטח של ה-MICUs. המתינו חמש דקות כדי לאפשר לביומולקולות שבדגימה להיקשר לפני השטח של ה-Micah.
לאחר מכן, טפטפו בעזרת פיפט 50 עד 100 µL נוספים של בופר ספיגה (absorption buffer) אל תוך תושבת הפרוב של תא הנוזל. תוך הקפדה לא לגעת בפרוב, בראש ה-FM או ב-MICA עם קצה הפיפט, כווננו מחדש את הגלאי הפוטואופטי ויישרו שוב את הלייזר אל הקנטילבר במידת הצורך. לאחר מכן, השתמשו בתוכנת המכשיר כדי להחזיר את הפרוב למגע (reengage).
הגדילו את גודל הסריקה כדי לזהות אזורי עניין. עם השלמת הדמיה, לחצו מספר פעמים על סמל הנסיגה בתוכנת המכשיר כדי לשחרר את הפרובה. לבסוף, השתמשו במים מזוקקים כדי לשטוף ביסודיות את מחזיק הפרובה של תא הנוזלים ואת דיסק הדגימה.
לאחר מכן, נסו זאת עם אוויר דחוס. דוגמה לתמונת AFM מוצגת כאן. תשתית המיקה מספקת משטח שטוח ברמה המולקולרית שבו DNA וחלבונים יכולים להיספג.
דימוי של MICA לפני דגימות של ביו-מולקולות מספק ביקורת שלילית והערכה של רעשי הדימוי. דבר זה מספק גם רמה של ביטחון בכך שהקנטיליבר מכוון כראוי ושהדימוי העוקב של הדגימה יהיה מוצלח. DNA של פלזמה בעל גדיל כפול, אשר ככל הנראה נמצא במצב של super coiled, מזוהה בקלות על ידי המראה האסימטרי שלו וההשקעה האחידה על מצע ה-Micah שעד כה היה חסר מאפיינים.
קומפלקסים של חלבונים בגדלי חלקיקים מובחנים ניתנים להבחנה ייחודית גם מהמצע של ה-Micah. הבדלים בגודל החלקיקים מעידים על הטרוגניות של הדגימה ויכולים להועיל להערכת הסטוכיומטריה הגאומטרית של החלבון או הקומפלקס, או לפעילות ביוכימית. נצפו צורה אלכסונית כללית ואוריינטציה עקבית של חלקיקי החלבון.
כאן מוצג ארטיפקט של דימות, שכן החלבונים צפויים להיות מכוונים על מצע ה-Micah באופן אקראי. הגורמים האפשריים לארטיפקט שנצפה הם חריגה פיזית בקצה (tip) או דימות AFM בקצב סריקה מהיר מדי, בעוד שקונבולוציית קצה (tip convolution) מונעת חישובים של מדידת אורך מוחלטת בציר ה-x וה-Y; עם זאת, מדידת גובה בציר ה-Z ומדידות יחסיות ב-X וב-Y עשויות להיות שימושיות להערכת תכונות ביופיזיקליות של הביומולקולות המדומות. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לכוונן את הקנטילבר (cantilever) במדויק ולהתאים את הגלגול של גלאי הפוטו-דיטקטור בהתאם לפרוצדורת AFM בסיסית זו.
ניתן להוסיף שלבים אחרים, כולל שימוש בתא נוזלים להחלפת בופר, כדי לענות על שאלות נוספות כגון היכולת של מלווים מולקולריים (molecular chaperones) להשפיע על שחרור קולטני סטרואידים מאלמנטים התגובה של ה-DNA שלהם. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה יותר של אופן הדמיית חלבונים של DNA וקומפלקסים ביו-מולקולריים באמצעות מיקרוסקופיית כוח אטומי בתנאי בופר.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר שיטה של מיקרוסקופיה של כוח אטומי (AFM) במצב טפיחה (tapping mode) להדמיות של ביו-מולקולות, כגון פלסמיד DNA וחלבונים, בתנאי באפר קרובים למצב פיזיולוגי. השיטה כוללת טכניקות להכנת דגימות המשפרות את איכות הדימוי ואת הדיוק.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי העצבים
- ביופיזיקה
- ביוכימיה
רקע
- מיקרוסקופיית כוח אטומי (AFM) היא כלי רב עוצמה להדמיה של ביו-מולקולות.
- הבנת האינטראקציות בין DNA לחלבונים היא קריטית בביולוגיה מולקולרית.
- הכנת הדגימה חיונית להצלחת ההדמיה ב-AFM.
- הדמיה בזמן אמת בתנאים של תמיסת בופר יכולה לספק תובנות לגבי מבנים ביו-מולקולריים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה לדימוי של DNA וחלבונים במסננים מימיים באמצעות AFM.
- הדמיה של קומפלקסים של DNA-חלבון והארגון שלהם.
- סיוע בהבנת האינטראקציות של שaperons מולקולריים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת ביומולקולות בבופרים מתאימים.
- הגדרה וכיול של מכשיר ה-AFM.
- דימוי של דגימות על תשתית מיקה.
- ניתוח של גודל, כמות וארגון של הביומולקולות.
תוצאות עיקריות
- דימות מוצלח של DNA פלסמי דו-גליים ושל קומפלקסים של חלבונים.
- זיהוי הטרוגניות של הדגימה באמצעות הבדלים בגודל החלקיקים.
- ויזואליזציה של ארגון ה-DNA והחלבונים על פני השטח של המיקה.
- הדגמת יעילות השיטה בדימות בזמן אמת.
מסקנות
- שיטת ה-AFM מספקת תובבנות בעלות ערך לגבי אינטראקציות ביו-מולקולריות.
- הכנת הדגימה היא קריטית לקבלת תוצאות דימוי באיכות גבוהה.
- טכניקה זו יכולה לקדם את המחקר בתחומי הליווי של שפרונים מולקולריים (molecular chaperones).
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מיקרוסקופיית כוח אטומי (AFM) מאפשרת ויזואליזציה ישירה של DNA רקומביננטי, חלבונים והקומפלקסים שלהם בתנאי באפר דמויי פיזיולוגיים, ובכך תומכת בהסרת סיכונים מכניסטיים (de-risking) ובתיקוף מטרות בשלבים מוקדמים. יכולת זו מספקת למחקר ופיתוח בביופארמה (biopharma R&D)&צוותי פיתويرסમેન્ટ (D) בעלי תובנות מבניות ברזולוציה גבוהה וללא סימון, שהן קריטיות להבנת אינטראקציות ביו-מולקולריות והרכבה מורכבת. שילוב של דימוי AFM בתהליכי הגילוי מעלה את רמת הביטחון בחיזוי ומסייע בקבלת החלטות בנוגע למיון תיקי מוצרים בנקודות מפנה מרכזיות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ובפיתוח בביופארמה&D
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ויזואליזציה ישירה של קומפלקסים של DNA-חלבון וחלבון-חלבון מבהירה את ההרכבה המולקולרית ואת ספציפיות האינטראקציה.
- דימות AFM תומך בתיקוף פונקציונלי של המטרה על ידי חשיפת הסטוכיומטריה וההטרוגניות של הקומפלקס.
- מיפוי מבני של קומפלקסים ביומולקולריים מפחית עמימות מכניסטית בבחירת המטרה.
- דימות ללא סימון (Label-free) בתנאי בופר שומר על קונפורמציות טבעיות לצורך בדיקה מדויקת של היפותזות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- AFM מספק נתונים טופוגרפיים כמותיים להערכת הומוגניות הדגימה ויצירת קומפלקסים.
- תוצרי הדמיות מאפשרים סטנדרטיזציה שלPreparations של ביו-מולקולות עבור בדיקות המשך.
- ויזואליזציה בזמן אמת תומכת בחזרתיות ובמוכנות הבדיקה עבור קמפיינים של סריקה.
- הסתגלות הפלטפורמה מאפשרת שימוש חוזר במגוון מטרות של חלבונים וחומצות גרעין.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- דימות AFM מסייע בבחירת מודלים פרה-קליניים באמצעות אפיון של מקבצי ביו-מולקולות הרלוונטיים למחלה.
- תובנות מבניות תומכות בהתאמה של ביומרקרים טרנסלציונליים כאשר היווצרות קומפלקסים קשורה לתוצאות פונקציונליות.
- מדידות כמותיות מכוונות החלטות קידום מותאמות-סיכון במסלולים פרה-קליניים.
- הפחתת סיכונים מנגנונית מתאפשרת על ידי תצפית ישירה על אינטראקציות מולקולריות בתנאים פיזיולוגיים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
דימוי ב-AFM משתלב ברצף הגילוי, החל מבדיקת היפותזה ראשונית דרך זיהוי מולקולות מובילות (lead identification) ועד לתיקוף פרה-קליני, ובכך מספק יכולת אנליטית הניתנת לשימוש חוזר לחקירה מבנית.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשרת מיפוי מונחה-השערות של אינטראקציות חלבון-DNA וחלבון-חלבון ברמת המולקולה הבודדת.
- סריקה: מספקת פלטי דימוג כמותיים וניתנים לשחזור לצורך כיול ביצועי המבחן ואיכות הדגימה.
- אנליטיקה: מספקת נתונים טופוגרפיים וממדיים לצורך ניתוח השוואתי של קומפלקסים ביו-מולקולריים.
- מחקר תרגומי: תומכת ברציפות על ידי קישור מאפיינים מבניים לנקודות קצה פונקציונליות ורלוונטיות למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: ניתנת להתאמה למגוון רחב של ביו-מולקולות, ותומכת במספר תוכניות ומטרות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית את אי-הוודאות המכניסטית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של תהליכי דימוג ושיפור השחזוריות בין צוותים.
- ערך אסטרטגי: מספק מידע לקבלת החלטות של go/no-go ומבצע אופטימיזציה של הקצאת משאבים על ידי הבהרת הרכבה מורכבת.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים וקידום של מטרות מאושרות מבנית.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בהפעלת AFM, כיוון קנטילבר והכנת דגימות.
- נדרשת גישה למכשירי AFM ברזולוציה גבוהה ולתוכנות אנליטיות.
- סטנדרטיזציה בין צוותים חיונית להשגת דימות ופירוש נתונים הניתנים לשחזור.
- יש לבצע אופטימיזציה של הרכב הבאפר ובחירת התשתית עבור כל סוג של ביו-מולקולה.
- קונבולוציה של קצה הגש (Tip convolution) ומגבלות קצב הסריקה עשויות להשפיע על מדידות ממדיות מוחלטות.
