טכניקות מעבדה אספטיים: שיטות ציפוי

[קריין] פרוטוקול זה משלב טכניקה אספטית בשיטות זריעה המשמשות לבידוד, הרחבה או ספירה של מיקרואורגניזמים כגון חיידקים ופאגים. הפרו linearlyלים כוללים זריעה בשיטת קוצים (streak plating) של תרביות חיידקים לצורך בידוד מושבות בודדות; זריעה בשיטת מזיגה (pour plating) לקביעת ריכוז החיידקים; וזריעה בשיטת פריסה (spread plating) לספירת מושבות חיידקים חיות. שכבות של אגר רך (soft agar overlays) משמשות לבידוד פאגים וספירת פלאקים, בעוד שזריעת רפליקה (replica plating) מעבירה תאים מצלחת אחת לאחרה בתבנית מרחבית זהה. בסופו של דבר, היישומים המעשיים של טכניקות אלו לתרבית מיקרואורגניזמים נעים מזיהוי חיידקים בסביבות שונות ועד להתקדמויות טכנולוגיות בגנטיקה מולקולרית ובבדיקות ביולוגיות בספיקה גבוהה (high throughput bioassays).

- באופן כללי, אנשים שאינם מורגלים בשיטות זריעה אלו עלולים להתקשות, שכן המניפולציות דורשות תנועות מדויקות ומותאמות תוך הימנעות ממגע עם משטחים שאינם סטריליים. למידת הפרוצדורות השגרתיות הללו מחייבת הדרכה ותרגול. את הפרוצדורות תדגים רכזת המעבדה שלי, ד"ר Kris Reddi.

- [Narrator] התחילו בעבודה עם מיקרואורגניזמים על ידי הכרת כללי המעבדה ואמצעי הבטיחות, כולל סיווג סיכונים ביולוגיים, דה-קונטמינציה של פסולת וסילוקה. ודאו שכל המכשירים, התמיסות והמצעים להליכי הזריעה סטריליים. כמו כן, הגדירו מרחב עבודה נקי. נקו אותו עם חומר חיטוי. הגדירו מבער בנזן עם צינור המחובר לקו הגז, וסדרו את האספקה הדרושה עם חומרים המסומנים כראוי. המשיכו לשטיפת ידיים יסודית עם סבון אנטיספטי ומים חמים. ראשית, הרטיבו את הידיים במים חמים זורמים ואז מרחו ופזרו את הסבון באופן יסודי. שפשפו את הידיים בעוצמה תוך יצירת חיכוך בכל המשטחים, כולל האגודלים, גב האצבעות, גב כפות הידיים ותחת הציפורניים. לאחר מכן שטפו היטב להסרת שאריות סבון וייבשו באמצעות מגבות נייר המופצות ממתקן. לבסוף, בעזרת מגבת נייר נקייה, סגרו את הברז. הליך זריעת המריחה (Streak Plate) נועד לבודד תרביות טהורות של חיידקים, או מושבות, מאוכלוסיות מעורבות באמצעות הפרדה מכנית פשוטה. הוציאו צלחת אגר מקופסת קירור של 4 °C וחממו מראש לטמפרטורת החדר. בחרו כלי מתוך מערך המכשירים למריחת הצלחת. ודאו שהצלחת יבשה וללא עיבוי על המכסה. סמנו את תחתית צלחת האגר סביב השוליים. כאשר תהיו מיומנים, השתמשו בצלחת אחת עבור מספר דגימות. לאחר מכן הדליקו מבער בנזן כדי לעקר את הלולאה המתכתית בלהבה. התחילו במרחק של שלושה עד ארבעה אינצ'ים מהלולאה המתכתית, כאשר התיל נמצא בקצה הקונוס הכחול, החלק החם ביותר של להבת מבער הבנזן. כאשר המתכת הופכת לאדומה מחום, הזוזו את התיל כך שהלהבה תתקרב ללולאה. כדי לקרר את הלולאה, געו בשולי מצע האגר, דבר שייצור צליל של טיגון. המשיכו לאסוף את האינוקולום על הלולאה. הרימו את החצי התחתון של הצלחת. הניעו את הלולאה קדימה ואחורה מהשוליים למרכז ברבע הראשון של הצלחת. הניחו את הצלחת ההפוכה בחזרה על המכסה. עקרו שוב את הלולאה המתכתית בלהבה. סובבו את פטרי המעבדה ב-90 מעלות. געו עם הלולאה ליד סוף המריחה האחרונה תוך שימוש בתבנית קדימה ואחורה, חצו את החצי האחרון של המריחות ברבע הראשון, ואז עברו לרבע השני הריק. ברגע שהרבע השני התמלא, הניחו את הצלחת. חזרו על הליך המריחה עבור הרבע השלישי והרביעי תוך הימנעות ממגע עם הרבע הראשון. למריחה עם קיסם סטרילי ושטוח, החזיקו את הקצה הצר בעדינות בין האגודל לאצבע הטבעת בזווית של 10 עד 20 מעלות למצע, והשתמשו בקצה הרחב למריחת הרבעים. הפכו את הצלחת בחזרה על המכסה בין הרבעים וסלקו את הקיסם כראוי. המשיכו לדגירה של הצלחות הממורחות כשהן הפוכות. הליך זריעת השפיכה (Pour Plate) סופר את המספר הכולל של יחידות יוצרות מושבות (CFUs) על פני השטח ובתוך האגר של צלחת אחת. כוונו טיימר ל-10 דקות, ואז העבירו 18 mL של מצע אגר מומס מאמבט מים של 55 °C לבלוק חימום של 48 °C והמתינו 10 דקות להשתווות. סמנו את תחתית פטרי מעבדה סטרילית. במידת הרלוונטיות, ציינו את מקדם הדילול. כעת העבירו 1 mL של דגימה למרכז פטרי המעבדה. סגרו את המכסה. הסירו את הפקק מהמבחנה של האגר המומס והעבירו את שפת המבחנה הפתוחה דרך להבה. שפכו את האגר בזהירות לתוך פטרי המעבדה. סגרו את המכסה ואז ערבבו את הדגימה עם האגר על ידי סיבוב עדין של הצלחת. המתינו 30 דקות כדי לאפשר לאגר להתמצק. לאחר שהאגר התמצק, הפכו והניחו את הצלחת בחדר חם. זריעת פריסה (Spread-plating) שואפת להפריד מיקרואורגניזמים המצויים בנפח דגימה קטן על ידי פיזור מושבות תוצאתיות באופן שווה על פני שטח האגר. השוו צלחת לטמפרטורת החדר וסמנו אותה כראוי. מקמו את הצלחת על גבי פלטת סיבוב. פפטו 0.1 mL של דגימה למרכז האגר וסגרו את המכסה. השליכו את הטיפ למכל פסולת. טבלו את המוט המתכתי בכלי עם 70% אתנול, כך שיכסה את כל החלק התחתון של הפוזר ואת האינץ' הראשון של הגבעול, ואז נקזו. שרפו את עודפי האתנול על ידי העברה דרך להבת מבער בנזן. לאחר מכן, פתחו את מכסה צלחת האגר וקררו את הפוזר על ידי נגיעה באגר לאורך השוליים ליד הדופן. סובבו את פלטת הסיבוב באיטיות. החזיקו את הפוזר בעדינות על פני שטח האגר, ופזרו בהדרגה את הדגימה באופן שווה על פני כל הצלחת בתנועת קדימה ואחורה בזמן שפלטת הסיבוב מסתובבת. סגרו את המכסה ואפשרו לדגימה להיספג היטב במשך חמש דקות לפחות. לאחר מכן, דגרו את הצלחת ההפוכה. ראשית, סמנו את צלחת האגר כראוי. פתחו את מכסה צלחת האגר. לאחר מכן פתחו את מיכל חרוזי הזכוכית שעוקרו מראש ועקרו את השפה בלהבה. העבירו בזהירות 10 עד 12 חרוזי זכוכית סטריליים לצלחת אגר. סגרו את מכסה הצלחת ועקרו את שפת מיכל חרוזי הזכוכית לפני החזרת הפקק. כעת, פפטו את הדגימה למרכז האגר. בתנועה אופקית, נערו בעדינות את החרוזים על פני שטח האגר שבע פעמים. אם הפעולה בוצעה כראוי, ההליך נשמע כמו ניעור מאראקאס. סובבו את הצלחת ב-60 מעלות ונערו שוב אופקית שבע פעמים. שוב, סובבו את הצלחת ב-60 מעלות וחזרו על הניעור. ודאו שהדגימה נספגה. לאחר מכן, שפכו את החרוזים המזוהמים לכלי איסוף מסומן המכיל 10% אקונומיקה. דגרו את הצלחת ההפוכה. בדיקת פלאקים (plaque assay) משמשת בדרך כלל לגילוי וכימות של פאגים של חיידקים. גדלו את חיידקי האינדיקטור לשלב האקספוננציאלי ושמרו על קרח. לאחר מכן, סמנו שתי מבחנות מיקרוצנטריפוגה סטריליות כ-"פאג" וכ-"בקרה", והוסיפו 50 µL של דגימת פאג או בופר בהתאמה לכל אחת. לאחר מכן, סובבו את תרבית החיידקים בבלילה, העבירו מנה (aliquot) של חיידקים למבחנה סטרילית ובצעו וורטקס עדין לחיידקי האינדיקטור, ואז הוסיפו 500 µL של חיידקים לכל מבחנת ספיגה. ערבבו על ידי נקישה עדינה של המבחנות. לעולם אל תבצעו וורטקס או פיפטור בעוצמה לדגימות פאג. דגרו את תערובת הפאג-חיידקים בטמפרטורה המתאימה לזן האינדיקטור למשך 20 דקות. בינתיים, העבירו שתי מבחנות אגר רך מאמבט מים של 55 °C לבלוק חימום של 48 °C. השוו למשך 10 דקות. סמנו שתי צלחות אגר קשה מזין ללא עיבוי, שהושוו מראש לטמפרטורת החדר. הוציאו מבחנת אגר רך מבלוק החימום ובדקו שהתוכן אינו חם מדי למגע. לאחר מכן, העבירו באופן אספטי את התערובת ממבחנת ספיגת הפאג למבחנת האגר הרך. לאחר מכן, סובבו במהירות בין כפות הידיים כדי לערבב את התוכן. כאשר המבחנה ביד אחת, פתחו את מכסה צלחת האגר הקשה ביד השנייה. שפכו מיד את כל תוכן המבחנה על פני שטח של צלחת אגר קשה. נערה את הצלחת במהירות ובעדינות. סגרו את המכסה והניחו את הצלחת על משטח מפולס למשך 30 דקות עד שהאגר הרך יתמצק. לאחר מכן, חזרו על ההליך עבור מבחנת בקרת הספיגה על ידי העברת תערובת הבקרה למבחנת אגר רך. ערבבו אותה, שפכו את התוכן על צלחת אגר קשה, נערה אותה, ואפשרו לאגר הרך להתמצק למשך 30 דקות. בדקו את הצלחות לאיתור היווצרות פלאקים. כדי לבודד פלאק מתערובת הטרוגנית, נקבו בזהירות את המרכז בעזרת קיסם סטרילי והעבירו את האינוקולום למבחנת מיקרוצנטריפוגה סטרילית המכילה 100 µL של בופר פאג. המשיכו לטהר ליזט זה על ידי חזרה על בדיקת הפלאקים שלושה עד שישה פעמים עם דילולות סדרתיות במידת הצורך. זריעת שכפול (Replica plating) מנצלת פנוטיפ בריר על ידי מתן אפשרות להשוואה בין צמיחת תאים בצלחת ראשית לבין צלחות משניות. סמנו רשת בתחתית הצלחת, סמנו את הצלחת הראשית ומספרו את הריבועים שהתקבלו. כעת, השתמשו בטכניקה אספטית כדי להוציא קיסם שעוקר מראש מהכלי, טפלו במרכז כל ריבוע עם דגימת תאים, וסלקו את הקיסם למכל פסולת מתאים. דגרו את הצלחת הראשית. ערמו את הצלחת הראשית ואת כל הצלחות המשניות. הניחו סימון אוריינטציה בצד של החצי התחתון של הצלחות. כעת הוציאו בד קטיפה סטרילי מעטיפתו והניחו אותו על הגליל הגלילי. לאחר מכן, הניחו את המחזיק תוך התאמת הסימונים שעל המחזיק לאלו שעל הגליל. שימו לב לסימון האוריינטציה על הגליל והמחזיק. לאחר מכן, הסירו את המכסה מהצלחת הראשית. יישרו את סימוני האוריינטציה על הצלחת ועל הגליל. הורידו את הצלחת כך שפני השטח של האגר יבואו במגע עם בד הקטיפה. בעזרת קצות האצבעות, לחצו קלות אך באופן שווה על גבה של הצלחת הראשית ולאחר מכן הרימו אותה בזהירות מהגליל. ודאו שניתן לראות את טביעת התאים על הקטיפה. החזירו את המכסה לצלחת. כעת, חזרו על הפרוטוקול ברצף על בד הקטיפה עם כל אחת מהצלחות המשניות. השתמשו בטביעת התאים מהצלחת הראשית כדי לזרוע עד שמונה צלחות משניות, המסודרות מהמצע הפחות נוח ליותר נוח. לבסוף, כבקרה חיובית, עבור הצלחת האחרונה בסדרה, השתמשו במצע אגר שבו כל הזנים שנבדקו אמורים לגדול. הדביקו את הצלחות ההפוכות יחד ודגרו אותן. בדקו את הצלחות המשניות לאיתור צמיחה. כבו את מבער הבנזן ואז פנו את כל הציוד. הניחו ביגוד מעבדה מזוהם, כלי זכוכית ופסולת מסוכנת במכל הסילוק המתאים. נקו את אזור העבודה עם חומר חיטוי. לבסוף, שטפו ידיים ביסודיות עם סבון אנטיספטי ומים חמים. Serratia Marcescens היא פרוטאו-בקטריה גראם-שלילית בצורת מוט המייצרת פיגמנט אדמדם הנקרא prodigiosin. היא נמצאת בדרך כלל בצמיחה בחדרי רחצה ועל וילונות מקלחת. בדוגמה זו, טכניקת זריעת המריחה מייצרת מושבות בודדות ברבע הרביעי. ניתוח זה של חיידקים הנמצאים בדגימת מים שנאספה מברזיה ציבורית משתמש בטכניקת זריעת השפיכה. שימו לב להבדל במראה המושבות. מושבות שטח הן גדולות ועגולות, בעוד שחלק ממושבות השטח הן קטנות מאוד ובעלות צורה לא סדירה. טכניקת זריעת הפריסה היא מרכיב חשוב בניסויי העשרה, ברירה וסריקה. לדוגמה, שיטת ה-copacabana היא כלי מבחין בסריקת כחול-לבן הקלאסית בטכנולוגיית DNA רקומביננטי. Phage T4 הוא פאג DNA דו-גדילי וירולנטי המדביק את מאוחרו Escherichia coli כדי ללוות ולשחרר פאגים צאצאים. בדיקת פלאקים זו על אגר EHA מראה פאגים באזורי הבהרה בקוטר של כ-1 מ"מ. בהיעדר חלקיקי פאג מדביקים, צמיחת חיידקים גורמת לתליה עכורה של תאים באגר הרך, שבה לא ניתן לראות מושבות נפרדות. בטכניקת ציפוי האגר הרך, מורפולוגיות הפלאקים משתנות. לדוגמה, כאן אותו זן מאוחר של mycobacterium מייצר מורפולוגיות פלאקים שונות בנוכחות משמידי פאג microbacteria לעומת mycobacteria phage MSSS. כוחה של זריעת השכפול הוא בסריקה בו-זמנית של מספר רב של מיקרואורגניזמים. במקרה זה, ארבעה זני pseudomonas נבדקו בכפולות לצמיחה על שלושה מקורות פחמן שונים: Acetamide, lactose ו-glycine. כאן, הצלחת הראשית היא מצע YTA מלא שזורע עם ארבעת הזנים כפי שצוין. הזנים מראים דפוסי צמיחה משתנים על צלחות שכפול של מצע MSA מינימלי המועשר במקור פחמן בודד: acetamide, lactose או glycine. כל הזנים גדלים על צלחת הבקרה החיובית האחרונה, מה שמאשר שתאים הועברו לכל הצלחות המשניות בסדרה זו. טבלה של תוצאות צלחות שכפול אלו מפרטת סריקה בו-זמנית של זני הבר השונים לדרישות צמיחה אופייניות.

- לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של אופן ביצוע פרוצדורות של זריעה בצלחות ללא זיהום של המצעים או התרביות, וכן כיצד להשתמש בשיטת הזריעה המתאימה לכל משימה ניסויית נתונה במעבדה. השגת מיומנות בטכניקות אלו דורשת תרגול. עם זאת, באמצעות הכשרה נכונה, פרוצדורות הזריעה המתוארות בסרטון זה יהפכו לטבע שני בעת העבודה על שולחן המעבדה.