טכניקות לניתוח של תאית שלפוחית ​​שימוש cytometry הזרימה

המטרה הכוללת של הליך זה היא לבודד ולנתח את זרימת השלפוחית החוץ-תאית בדם בשתי שיטות שונות. לשיטת זיהוי השלפוחית החוץ-תאית האינדיבידואלית. פלזמה ירודה של טסיות דם או PPP מבודדת תחילה מדגימת דם.

לאחר מכן ה-PPP מוכתם בנוגדנים מצומדים פלואורוכרומיים מעניינים. בשיטת הזיהוי המבוססת על חרוזים, השלפוחיות החוץ-תאיות מודגרות בחרוזים, ולאחר מכן השלפוחיות הקשורות לחרוזים מוכתמות בנוגדנים המצומדים הרלוונטיים של פלואורוכרום. בסופו של דבר, ניתן לקבוע את תכולת השלפוחית החוץ-תאית המסתובבת על ידי ניתוח הדגימות על ידי ציטומטריית זרימה.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות כמו מיקרוסקופ אלקטרונים או הפרדת חרוזים מגנטיים, הוא שהיא הרבה יותר מהירה ומאפשרת להעריך את אוכלוסיית האסקלים החוץ-תאיים הכוללת במקום להיות מוגבלת לתת-אוכלוסיות ספציפיות. בדרך כלל, אנשים חדשים בשיטה זו יתקשו מכיוון שהצלחת שיטה זו דורשת הקפדה על התמרונים המודגמים ופרמטרי הגדרת הציטומטר על מנת לייצר נתונים באיכות גבוהה עם שונות יומיומית מינימלית, התחל בצנטריפוגה של דגימות דם מלא כדי להפריד את הפלזמה ממעיל באפי והתאים האדומים. לאחר מכן, העבירו 1.2 מיליליטר של סופרנטנט הפלזמה לתוך צינורות צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר, תוך הקפדה לא להפריע לשכבות התחתונות המכילות את מעיל הבאפי והתאים האדומים ואז צנטריפוגה שוב את הסופרנטנט כדי להסיר טסיות דם ושברי תאים גדולים.

בסוף הסיבוב, העבירו בזהירות את כל דגימות ה-PPP מלבד 200 המיקרוליטרים האחרונים לצינורות חדשים, תוך הקפדה לא להפריע לכדורים. לאחר מכן מערבבים את הפלזמה למעלה ולמטה מספר פעמים ומעבירים 320 מיקרוליטר מכל דגימה לשורה העליונה של צלחת 96 בארות. כדי להכתים את הדגימות, שלב את הנוגדנים המעניינים עבור כל אחד משלושת הפאנלים לנקודות אפס בודדות של 22 מיקרומטר, צינורות סינון צנטריפוגליים, וסובב את הנוגדנים באמצעות צנטריפוגה בזווית קבועה ובמהירות אחת.

כאשר כל הנוגדן עבר דרך המסנן, הוסף את הכמות המתאימה של התערובת לכל באר של צלחת 96 הבארות כפי שמתואר באיור. לאחר מכן, השתמשו בפיפטה רב-ערוצית כדי לערבב את דגימות ה-PPP ולאחר מכן העבירו 100 מיקרוליטר מכל דגימה לנוגדנים בשורה השנייה. לאחר מכן ערבבו שוב את הדגימות, החליפו את הקצוות והעבירו 100 מיקרוליטר של דגימה לכל אחת משתי שורות הנוגדנים הבאות לפי הצורך.

לניסוי. דגרו את הצלחת בארבע מעלות צלזיוס לאחר 30 דקות ב-220 מיקרוליטר PBS לבאר כדי לשורות 6 עד 8 בתוך ארון בטיחות ביולוגי. לאחר מכן בעזרת פיפטה רב-ערוצית מתכווננת לרוחב, העבירו את תכולת כל באר לצינור המסנן הצנטריפוגלי המתאים לה מבלי לשנות את הקצוות.

השתמש ב -200 מיקרוליטר PBS מאחת משורות הכביסה כדי לשטוף את הבארות שמהן הוצאו הדגימות זה עתה. לאחר מכן העבירו את תמיסת השטיפה לאותם מסננים שאליהם נוספו בעבר דגימות ה-PPP, וסגרו את המסננים הצנטריפוגליים. לאחר שכל דגימות ה-PPP המוכתמות הועברו יחד עם תמיסות השטיפה שלהן, סובב את הדגימות בצנטריפוגת רוטור קבועה.

לאחר הסיבוב, ודא שלא יישאר נוזל על גבי המסננים. לאחר מכן השעו מחדש את החלק העליון של המסננים ב-300 מיקרוליטר של PBS והעבירו את התוכן המושעה לצינורות מסומנים מראש לניתוח ציטומטרי זרימה מיידי. שטיפת הדגימות המוכתמות באמצעות מסננים צנטריפוגליים, משפרת את ההפרדה בין אותות הרקע לאותות הסמן החיוביים.

עם זאת, חשוב לציין שחלק מהשלפוחיות החוץ-תאיות הקטנות יותר, כולל אקסוזומים, עלולות ללכת לאיבוד דרך דלתות המסנן כדי לנתח את הדגימות, ראשית, הגדר את פרמטרי מתח הפיזור קדימה והצד לסולם לוג ובחר את הספים הנמוכים ביותר המותרים על ידי הציטומטר עבור כל פרמטר. לאחר מכן, תוך כדי הפעלת שפופרת של נקודת אפס 22 מיקרומטר, PBS מסונן מכוון את המתחים הללו לערכים הגבוהים ביותר שאינם כוללים את רוב רעשי הרקע. לאחר מכן, הפעל צינור המכיל תערובת של חרוזים, מיקרומטר אחד ומטה, וצייר שער סביב אוכלוסיית החרוזים בתרשים פיזור קדימה זה לצד זה כדי ללכוד את כל האירועים מתחת לחרוזים של מיקרומטר אחד.

כעת הגדר את קצב הזרימה של הציטומטרים לנמוך והשתמש בחרוזים כדי להתאים את חוגת קצב הזרימה בציטומטר לקצב האירועים הרצוי. לאחר מכן, באמצעות שפופרת של חלקיקי פלואורסצנט קשת המדוללים ב-PBS רוכשים 5,000 אירועים, רושמים את העוצמה הממוצעת של הערכים עבור פיזור צד הפיזור קדימה, וכל ערוץ צבע. כאשר כל הפרמטרים מוגדרים, הפעל כל דגימה למשך דקה או שתיים בדיוק לאחר השלמת הקריאה הראשונה עבור כל שפופרת, ערבב 20 מיקרוליטר של 10% MP 40 לכל דגימה, וקרא מחדש את הצינורות לאותו פרק זמן כדי לאפשר חיסור של האירועים החיוביים שהתגלו בדגימה הליזה לאורך פרק זמן שווה.

כדי לזהות את השלפוחיות החוץ-תאיות על ידי לכידה מבוססת חרוזים, התחל בשטיפת חרוזי פוליסטירן שישה מיקרומטר לא מצופים פעמיים במדיה RPMI, ולאחר מכן Resus בשני מיליליטר מאותו הדבר. לאחר מכן, הוסף 6,000 חרוזים לכל שפופרת פקס חדשה לשפופרת הבקרה השלילית ב-400 מיקרוליטר מדיה לכל הצינורות האחרים ב-200 מיקרוליטר שלפוחיות חוץ-תאיות PPP או אולטרה-צנטריפוגה לפי הצורך, ו-200 מיקרוליטר מדיה. התאם את הנפח הסופי בכל צינור ל -400 מיקרוליטר.

עם יותר מדיה. דגרו את הצינורות למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס על שייקר. למחרת בבוקר יש לשטוף את החרוזים בשני מיליליטר מדיה.

שאפו את הסופרנטנט וחסמו כל קשירה לא ספציפית עם 400 מיקרוליטר של אלבומין סרום בקר 5% הנח על שייקר בארבע מעלות צלזיוס למשך שלוש שעות. לאחר שלוש שעות יש לשטוף את החרוזים בשני מיליליטר מדיה נוספים ולהשעות את הכדורים ב -100 מיקרוליטר של מדיום טרי. כעת מסננים את הנוגדנים ומוסיפים את הנפח המתאים של קוקטייל נוגדנים מסונן לכל צינור, ולאחר 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס, שוטפים את החרוזים בשני מיליליטר נוספים של מדיה.

הפעם השעו מחדש את הכדורים ב-400 מיקרוליטר מדיה ונתחו מיד את הדגימות על ידי ציטומטריית זרימה, והתאימו את פרמטרי הפיזור הפנימיים קדימה לסף הנמוך ביותר המותר על ידי ציטומטר הזרימה כפי שהודגם זה עתה. לבסוף, שער על אוכלוסיית החרוזים הבודדים ורכוש 2000 אירועים לכל מדגם. ניתן להשתמש הן בשיטות הזיהוי האישיות והן בשיטות הזיהוי המבוססות על חרוזים כדי לזהות את נוכחותן של השלפוחיות החוץ-תאיות בדגימות ה-PPP כפי שמודגם על ידי עלילות הנקודות הללו עבור בדיקת הזיהוי האינדיבידואלית, הבקרה הליזה משמשת להגדרת השערים עבור הדגימה המתאימה שאינה רשומה.

רוב האירועים צריכים ליפול בתוך שער השלפוחית החוץ-תאית. לדוגמה, באיור זה, תרשימים דו-פרמטרים אלה הראו את זיהוי הסמנים, CD 1 0 8 A ו- CD 2 35 A, שהם שני סמני תאי דם אדומים הידועים כמתקיימים במקביל על תאים. כצפוי, למעלה ממחצית האירועים החיוביים על השלפוחיות החוץ-תאיות הם חיוביים לשני הסמנים, ואילו בתרשים לפי פרמטרים, ביטוי השלפוחית החוץ-תאית של שני סמנים שידוע שאינם מתקיימים במקביל על התאים מציג אוכלוסיות חיוביות נפרדות נפרדות בשיטת הזיהוי מבוססת החרוזים.

לא קיימת הפרדה בין האוכלוסייה החיובית לאוכלוסייה השלילית ואירועים מופיעים ברבעים החיוביים הכפולים, למרות שהם בדרך כלל לא נמצאים באותם סוגי תאים בשל העובדה ששני סוגי השלפוחיות החוץ-תאיות נקשרים לחרוז יחיד. לכן, נתונים משיטה זו מנותחים בצורה הטובה ביותר באמצעות היסטוגרמות המכוסות בנתוני הבקרה השליליים, עם שינוי ניכר בביטוי הסמן שנצפה בדגימות החרוזים בהשוואה לבקרות לאחר השליטה. ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לנתח 12 דגימות דם עם שלושה פאנלים של נוגדנים תוך שלוש עד ארבע שעות בשיטת הזיהוי האישית או תוך יום וחצי בשיטת החרוזים אם היא מבוצעת כראוי.

בעת ניסיון הליך זה, חשוב לזכור להיות עקבי בטיפול בכל דגימה, לוודא שקצב הזרימה הציטומטרי ועוצמות הפלואורסצנט הותאמו כהלכה בתחילת כל ניסוי כך שיתאימו להגדרות הניסוי של היום הקודם, במיוחד בעת הפעלת דגימות מרובות על פני מספר ימים.