אנושי במבחנה דיכוי ככלי מיון עבור הכרה של מדינת מוקדם של חוסר איזון החיסון

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא להשתמש במבחן דיכוי אנושי in vitro כדי למדוד את תפקודן של תאי treg ולהעריך פוטנציאלית אובדן עתידי של תפקוד זה. הדבר מתבצע תחילה באמצעות הכנה ובדיקה של חרוזיים (beads) מקודדים, שישמשו כמעוררי תאים. השלב השני הוא בידוד של תאי T נאיביים טהורים CD4+, CD25-, תאי T מופעלים in vivo מסוג CD4+, CD25 low, ותאי T רגולטוריים מסוג CD4+, CD25 high, יחד עם תאי PP BMCs מקרינים שישמשו כתאים מציגי אנטיגן או APCs.

בשלב הבא מכינים תרביות בודדות של T-cells נאיביים או מופעלים כמעניבים (responders) עם P BMCs כ-APCs, או תרביות משולבות (co cultures) תחת אותם תנאים, אך עם הוספת tregs ביחס של 1 ל-10. השלב האחרון הוא קציר התאים ומדידת השכיעות (proliferation) שלהם באמצעות שילוב של Thymidine טריטיומי. התוצאות המתקבלות בסופו של דבר יכולות להדגים הבדלים בדיכוי של תגובות T-cell נאיביים לעומת T-cell שהופעלו in vivo.

שמי ג'ף וודקליף. תאי T רגולטוריים אינם מבטאים סמנים ייחודיים על פני התא. לכן, כדי למדוד את תפקודם באופן מהימן, יש לבודדם באמצעות טכניקות המעניקות את ההפרדה הטובה ביותר.

היתרון המרכזי בשימוש במיון תאים מופעל פלואורסצנציה (FACS) על פני שיטות אחרות, כגון בידוד מקסימלי, הוא רמת טוהר אוכלוסיות התאים שניתן להשיג. כך ניתן לבחון באופן מהימן את תפקודי התאים במבדקי דיכוי in vitro, כפי שמוצג כאן. עם זאת, שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי תפקוד treg בנבדקים בריאים ובנבדקים הקשורים לסוכרת מסוג 1. ניתן להחילה אותה גם על מחלות אוטואימוניות אחרות, כגון דלקת מפרקים שירומית אנושית, לופוס אריתматоזוס סיסטמי, טרשת נפוצה ואחרות. כדי לצפות חרוזי הפעלה של taal ב-anti-human CD3.

הוסיפו מיליליטר אחד של חרוזי M four 50 toil פעילים מהמבחנה המקורית למבחנה של 1.5 מיליליטר, והניחו את המבחנה במעמד מגנטי עד שכל החרוזים יידבקו לדופן המבחנה. לאחר מכן, הסירו את בופר החרוזים על ידי שאיבה בעזרת פיפטה בעוד המבחנה עדיין נמצאת במעמד המגנטי. הוציאו את המבחנה מהמעמד המגנטי והוסיפו מיליליטר אחד של בופר 1.

הניחו את המבחנה במעמד המגנטי שוב ושוב. הסירו את התמיס הרגיל (buffer) בעוד המבחנה נמצאת במעמד המגנטי. פזרו מחדש (Resus), השעו את החרוזים ב-1 mL של buffer one פעם נוספת.

הפעם הוסיפו גם 40 µL של anti-human CD3. ערבבו את החרוזים ואת הנוגדן בטמפרטורה של 37 °C למשך 15 דקות. לאחר מכן, הוסיפו 0.1% w/v BSA, והמשיכו בערבוב במשך 16 השעות הבאות.

בשלב הבא, שטפו את החרוזים פעמיים עם באפר 2 על ידי הדגרת החרוזים ב-1 ml של באפר 2 למשך חמש דקות בטמפרטורה של 2 עד 8 °C, ולאחר מכן הסירו את הבאפר בעוד המבחנה נמצאת במגנט.

בשימוש במיליליטר אחד של באפר 3, בחנו את יעילות ציפוי הנוגדן על ידי הוספה של מספר משתנה של חריזים מצופים ב-CD3 לכל תא, כדי לקבוע את היחס האופטימלי; זרעו 50,000 PBMC לכל באר בשלוש חזרות בלוח 96 בארי. לאחר 72 שעות של תרבית בטמפרטורה של 37 °C, הוסיפו 1 µCi של תימידין טריטיומי והמשיכו בדגירה למשך 16 השעות הבאות. קצרו את התאים בלוח קציר רב-מסך או בלוח דומה.

הוסיפו נוזל סינטילציה ומדדו את מספר הספירות לדקה (CPM) עבור כל באר. באמצעות מונה סינטילציה מסוג TopCount NX-T, או מכשיר דומה, קבעו את היחס בין חרוזי הסינטילציה לתאים; על פי ניסיוננו, יש לבחור את היחס שנותן באופן עקבי CPM גבוה מ-5,000 אך נמוך מ-15,000. יחס של שלושה חרוזים לתא נותן בדרך כלל את הגירוי האופטימלי הן עבור תאי המשיבים (responder cells) והן עבור תאי treg בכל הנבדקים האנושיים שנבחנו.

מלאו מבחנה קונית של 50 מיליליטר ב-15 מיליליטר של fal plus. לאחר מכן, בצעו דילול של 1 ל-6 ל-50 מיליליטר של buffy coat על ידי הוספת 250 מיליליטר של PBS למבחנה הדם. העבירו באיטיות 25 מיליליטר של ה-buffy coat המדולל מעל ה-fial pack, תוך הקפדה שלא להפריע לשכבות.

סבב במרכזית ב-800 ×g למשך 30 דקות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס. כאשר הבלם כבוי, אסוף בזהירות את שכבת ה-PBMC, שהיא הפאזה הבינונית הלבנה בין הפלאסמה לבאפר. במידת הצורך, גרד תאים מהדפנות של המבחנה.

המתינו מספר דקות ואספו אותם שוב מהפזה הבינונית. העבירו את התאים למבחנות נקיות של 50 מיליליטר ושטפו אותם על ידי מילוי המבחנות ב-PBS עד להשקעה (pellet). ה-PBM cs.

חזור על שלב השטיפה פעמיים בכל פעם. שלב שני משקעי תאים בתוך מבחנה אחת, ובסופו של דבר איחד את כל משקעי התאים לתוך מבחנה אחת של 50 milliliter. לאחר מכן, השתמש ב-20 microliters של התאים התלויים כדי לקבוע את חיוניות התאים באמצעות שיטת הדירה של trypan blue.

ייצרו APCs לצורך בדיקה על ידי העברה של 1 mL של pbmc חיוניים למבחנה חדשה. לאחר מכן, הוסיפו 4 mL של מדיום והקרינו את התאים ב-5,000 rads; מלאו עד הסוף את המבחנה המכילה את שאר ה-P BMCs בבופר PBS. לאחר ספינטציה של התאים ב-250 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C, שפכו את העל-נוזל והשביעו מחדש את התאים ב-4 mL מאותה תערובת.

לאחר מכן, הוסף 200 µL של max anti CD4 microbeads ל-pbmc והדגה את תערובת התאים והחרוזים בטמפרטורה של 4 °C למשך 20 דקות. לאחר ההדגיה, שטוף את התאים ב-40 mL של PBS buffer, ולאחר מכן שקיע את התאים בצנטריפוגה. לאחר מכן, שפוך את העל-מסננת (supernatant) והשהה מחדש את התאים ב-8 mL של Degas PBS buffer בטמפרטורת החדר.

בשלב הבא, השתמשו במסנני הפרדה כדי לסנן ולהפריד את תרחיף התאים. לאחר מכן, חלקו את ה-PBM CS לשתי מבחנות בנפח 15 מיליליטר. הוסיפו ארבעה מיליליטר של P BMCs לכל מבחנה.

הצמידו בעזרת דבק עבה שתי עמודות למפריד מינימקס (minimax separator) והניחו מבחנות איסוף מתחת לכל עמודה. לאחר מכן, הוסיפו שלושה מיליליטרים של DGAs PBS buffer לכל עמודה. כאשר לא יישאר באפר, שפכו את כל תמיסת התאים בנפח של ארבעה מיליליטרים מכל מבחנה מעל העמודות לפני שתמיסת התאים תתרוקן לחלוטין. הוסיפו שלושה מיליליטרים של DGAs PBS buffer בטמפרטורת החדר לכל עמודה והמתינו עד שהבאפר יעבור למבחנות האיסוף.

הוסיפו עוד בופר עד שהנוזל שיוצא יהיה צלול. העבירו באמצעות פיפטה חמישה מיליליטרים נוספים של בופר DGAs לעמודי ה-LS, ולאחר מכן הוציאו את עמודי ה-LS מהמפריד המינימקס (minimax separator). הניחו את העמודים לתוך מבחנות איסוף סטריליות חדשות בנפח של 50 מיליליטר.

הנח לחצי מיליליטר לזרום החוצה ולאחר מכן דחף באיטיות את שאר הנפח החוצה, שהם כארבעה מיליליטרים. כעת, שלב את שני השברים החיוביים ל-CD4. לאחר מכן, הוסף עד 50 מיליליטרים של PBS לפחל וספור את התאים לאחר סבב צנטריפוגה של התאים ב-400 ×g למשך 10 דקות בטמפרטורה של 4 °C.

ששוב את התאים בשני מיליליטר של בופר PBS. שלב את הנוגדנים שישמשו לצביעת העובדות במבחנה אחת: anti CD 14, CD 32, CD one 16 ובמידת הצורך anti CD four. קח מנה (aliquot) מהתערובת לצורך צביעת מבחנה אחת ללא FLUOROCHROME.

הכינו את מבחנת ה-FMO על ידי העברה של חמישה µL מת сусפנסיית התאים מהמבחנה למבחנת fax, וצבעו את התאים באמצעות שני µL מתמיסת הנוגמים (antibody cocktail) שהוכנה מראש. לאחר מכן, הוסיפו תאים לא צבועים וחרוזיים מצופים ב-mouse IgG לצביעה עם פלואורוכרום בודד למבחנות fax נפרדות, לצורך שימוש כבישורי פיצוי (compensation controls) עבור מיון תאים. לאחר מכן, הוסיפו 50 µL של anti-human CD 25 PE לתמיסת הנוגמים, והוסיפו את התמיסה לשארית סספנסיית התאים.

דגרו את המבחנות בטמפרטורה של 4 °C למשך 30 דקות. לאחר דגירת התאים עם תערובת הנוגדנים, הוסיפו למבחנות PBS ואז השקיפו את התאים. השעיקו את המשקע בבופר PBS בריכוז של 10⁷ תאים למיליליטר.

השתמשו בנבובת ה-FMO כדי לקבוע את סף המיון של תאי T חיוביים ל-CD 25. באמצעות אסטרטגיית גייטינג זו, קבעו תחילה גייט סביב התאים השליליים ל-CD 4 כדי להוציא את התאים החיוביים ל-CD 4, הכוללים מונוציטים, מקרופאגים וכל שאר התאים שאינם תאי T וחיוביים ל-CD 4, כפי שמוצג באיור זה. בגרף נפרד, שרטטו גייטים עבור תאי T שליליים ל-CD 25, תאי T עם רמה נמוכה של CD 25 ותאי treg עם רמה גבוהה של CD 25, כפי שמוצג באיור זה.

לאחר הזרימה ומיון תתי-אוכלוסיות התאים, שקיעו את השפופרות האיסוף ושמרו את תאי ה-T על קרח עד להזרקה לצלחות. סמנו פלטת 96 בארות בעלת תחתית בצורת U כפי שמוצג בטבלה. תלו בתוך פלטת 96 הבארות מנה של 50 µL של חרוזים מצופים ב-CD3, בריכוז שחושב לשלושה חרוזים לכל תא מגיב לכל בארה, בתוך מצע מלא עם 10% pooled human AB serum, ולאחר מכן דללו את ה-APCs שהוקרנו קודם לכן במצע לריכוז של 5 × 10⁵ תאים למיליליטר.

הוסיפו 50 µL מהתאים ללוח 96 בארות, ולאחר מכן הוסיפו 2.5 × 10⁴ תאי T שהם CD4 positive CD25 negative או CD4 positive CD25 low לכל בארה, בשלוש חזרות. הוסיפו tregs לשורה B ולבארות המסומנות כ-tregs בלבד של התרבית המשותפת (co-culture) ביחס של 1:10, כפי שמוצג כאן. לאחר מכן, דגרו את הלוח בטמפרטורה של 37 °C בתוך אינקובטור עם 5% CO2 ובלחות רוויה למשך 72 שעות. לאחר מכן, בצעו פעימה (pulse) לתאים באמצעות 1 µCi של thymidine טריטיומי, והמשיכו בדגירה בטמפרטורה של 37 °C למשך 16 השעות הבאות, לאחר שה-thymidine נטמע בשעות האחרונות של התרבית המשותפת.

השתמשו ב-filter mate harvester כדי לאסוף את התאים מלוח איסוף רב-מסננים (multi-screen harvest plate). לאחר מכן, כסו את לוח האיסוף במכסה פלסטיק שקופה שמולאה מראש בנוזל סינפילציה (scintillation fluid). לבסוף, קראו את ה-CPM לכל באר.

באמצעות מונה סינטילציה ניתן לבודד תתי-אוכלוסיות של תאי T בדרגת טוהר גבוהה באמצעות מערכת זו, כפי שניתן לראות בסדרה הבאה של תרשימי נקודות (dot plots). תאי T שהם CD4 חיוביים ו-CD25 שליליים מוצגים כאן בשער התחתון. בדמות הבאה, ניתן לראות תאי T שהם CD4 חיוביים ו-CD25 נמוך בדרגת טוהר גבוהה. אוכלוסייה טהורה של תאי CD4 חיוביים שעברו מיון באמצעות זרימה (flow sorted).

תאי treg עם ביטוי גבוה של CD 25 מוצגים בשער הבקרה העליון. תרביות של סוגי תאים בודדים של APCs ותאי treg מנבדקים בריאים הראו שגשוג מועט עד חסר מעל הרקע, כפי שנמדד על ידי שילוב תימידין, בעוד שתאי T נאיביים עם ביטוי שלילי של CD 25 ותאי T שהופעלו in vivo עם ביטוי נמוך של CD 25 הראו שגשוג ניכר, אשר עוכב כאשר סוגי תאים מגיבים אלו תורבדו יחד עם תאי treg. עם זאת, נצפו הבדלים קלים ביכולתם של תאי treg לדכא תאי T נאיביים מגיבים עם ביטוי שלילי של CD 25 ותאי T מגיבים שהופעלו in vivo עם ביטוי נמוך של CD 25.

זוהה ביקורת שאינה סיגניפיקנטית. תרביות של סוג תא בודד של APCs ו-Tregs מנבדקים בסיכון הראו שגשוג מועט עד אפסי מעל הרקע, כפי שנמדד על ידי שילוב תימידין. לעומת זאת, תאי T נאיביים CD 25 שליליים ותאי T שופעלי-CD 25 נמוכים שהופעלו InVivo הראו רמות שגשוג נמוכות יותר בהשוואה לביקורות בריאות.

תאי T מגיבים עוכבו עוד יותר על ידי tregs ובתרביות משותפות, מאחר שהבדיקה מניבה תוצאות מהימנות. ניתן להסיק בנוסף שערכי CPM נמוכים מרמזים על פגמים פוטנציאליים בהעברת אותות, אשר יש לבחון אותם לעומק בסוג מחקר אחר. עם זאת, ההבדל ביכולתם של tregs לדכא תאי T מגיבים שליליים ל-CD 25 לעומת תאי T מגיבים עם רמות נמוכות של CD 25 בנבדקים בסיכון היה מובהק.

לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לחבר בצורה חלקה את כל השלבים הדרושים לצורך ביצוע בדיקה תפקודית מוצלחת ואמינה לנוכחות של Tregs בנבדקים בריאים ובנבדקים עם מערכת חיסון פגועה. לדוגמה, בנבדקים עם סוכרת מסוג 1.