מבחני Biophysical לחקור את תכונות מכניות של גרעין התא שלבי הביניים: מסננים תשתית יישומים מניפולציה Microneedle

המטרה הכוללת של הניסויים הבאים היא למדוד את התכונות המכניות של גרעין התא ואת הקשר הפיזי שלו עם שלד התא (cytoskeleton) המקיף אותו. דבר זה מושג על ידי הפעלת מאמץ מכני על תאים שהוחדרו על ממברנת סיליקון שקופה והדמיה של העיוותים הגרעיניים המושרים. עיוותים גרעיניים מוגברים תואמים לקשיחות גרעינית מופחתת, שכן שינויים בצימוד שבין הגרעין לשלד התא יכולים להשפיע אף הם על העיוותים הגרעיניים המושרים.

העברה של כוחות תוך-תאיים בין השלד התאי לגרעין נבחנת באופן ישיר על ידי הפעלת מאמץ מקומי על השלד התאי. לאחר מכן, מועתק דימוי של התעתקותן של מבני הגרעין והשלד התאי המסומנים פלואורסצנטית. התוצאות המתקבלות מציגות את קשיחותם של גרעיני התאים ביחס לשלד התאי הסובב אותם.

בהתבסס על ניסויי מאמץ של התשתית, בדיקת המניפולציה באמצעות מחטים מיקרוסקופיות (microneedle manipulation assay) חושפת כי שיבוש של הצימוד בין הגרעין לשלד התא גורם לפגמים בהעברה תוך-תאית של כוחות. היתרון המרכזי של טכניקות אלו על פני שיטות קיימות, כגון שאיבה של גרעינים מבודדים באמצעות מיקרו-פיפטה, הוא שהן מאפשרות מדידה של מכניקת הגרעין בתאים חיים ושלמים ללא הפרעה של הארכיטקטורה התאית הנורמלית. שיטות אלו יכולות לספק תובנות לגבי האופן שבו שינויים בהרכבת המעטפת הגרעינית יכולים להשפיע על התכונות המכניות של הגרעין.

ניתן להשתמש בהם גם כדי לחקור את תפקיד המכניקה הגרעינית בהקשר של מחלות כגון נוירופתיות LA או סרטן. כל כלי למתיחה מורכב מכלי פלסטיק ללא תחתית שהוכן במיוחד, בעל קוטר של שלושה אינצ'ים, וטבעת O מפלסטיק להחזקת ממברנת סיליקון המשמשת כתשתית לתרבית התאים. להכנת כלי המתיחה, קבעו פיסת ממברנת סיליקון בגודל של ארבעה אינצ'ים על ארבעה אינצ'ים בין טבעת ה-O לכלי, גזרו בזהירות את שאריות הממברנה, שטפו את כלי המתיחה במים דה-יונים, ולאחר מכן בצעו אוטוקלאב לכלי לפני ציפוי ממברנת הסיליקון במולקולות של מטריקס חוץ-תאי; סמנו נקודת ייחוס בחלק החיצוני של הממברנה במרכז התחתון.

סימן ייחוס זה יעזור בזיהוי אותם התאים במהלך ניסויי המתיחה להפעלת מתיחה חד-צירית. שני פסי דבק סקוטש מודבקים סביב נקודת הייחוס כדי להגביל את היווצרות הממברנה בממד אחד. כדי לספק היצמדות אופטימלית של תאים, יש לצפות את ממברנות הסיליקון ב-3 µg/mL של פיברונקטין או בכל חלבוני מטריצה חוץ-תאית מתאימים.

כסו את צלחת הסינון באמצעות צלחת פוליסטירן הפוכה של 10 סנטימטרים והדגרו אותה למשך לילה בטמפרטורה של 4 °C למחרת. שטפו את הממברנה פעם אחת עם PBS כדי להסיר חלבון עודף. מלאו את הצלחת ב-10 milliliters של מדיום גידול והניחו בצד.

לאחר הכנת צלחת ממבנה הסיליקון המצופה, יש לנתק את התאים באמצעות trypsin בריכוז 0.05% ולהזרים תאים דבקים אל הצלחת בתוך מדיום גידול. הליך זה מוצג באמצעות תאי עובר של עכבר.

דגמו פיברובלסטים או תאי mes והדגירו אותם למשך 24 עד 48 שעות בתנאי תרבית רגילים. מיקרוסקופ הפוך המותאם לניסויי מתיחה של תשתית כולל התקן מתיחה המורכב מלוח בסיס המותאם לבמה של המיקרוסקופ. הלוח מחזיק פלטה גלילית מרכזית, המשמשת להפעלת מתיחה על החלק המרכזי של קרום הסיליקון.

המכשיר כולל גם פלטה ניידת המחזיקה את כלי המתיחה ויכולה להחליק מעלה ומטה על ארבעה פיני הנחיה, וכן משקולת של חמישה פאונד להפעלת עומס. כדי להדגים את הגרעינים, דגרו את התאים בכלי המתיחה עם מיקרוגרם אחד למילליליטר של צבע hooked למשך 15 דקות ב-37 °C. לאחר הדגירה, שאבו את המצע והחליפו אותו ב-15 milliliters של מצע גידול נטול פנול אדום עם 25 millimolar heis.

לאחר מכן, הברג את הצלחת אל מחזיק הצלחות ומריח בזהירות גריז להיקף התחתון של ממבנה הסיליקון כדי להבטיח את החלקתו של הממבנה לאורך הפלטינה המרכזית. ודא שאת החלק המרכזי של הממבנה השארת נקי. הנח את לוח הבסיס על פלטת שולחן המיקרוסקופ והרכב בזהירות את מחזיק הצלחות על לוח הבסיס.

וודאו שבמצב המנוחה ההתחלתי, ממбраסת הסיליקון של כלי המתיחה מונחת באופן רפוי על הפלטינה המרכזית. לאחר מכן, התמקדו בתחתית ממбраסת הסיליקון ואתרו את נקודת הייחוס השחורה המרכזית. הנקודה תשמש כנקודת ההתחלה לכל רכישות התמונה ותסייע באיתור אותם תאים במהלך המתיחה ולאחריה.

בתמונה זו, הנקודה המרכזית ממלאה את כל שדה הראייה. החל מגבול הנקודה, כוון את הפוקוס כדי להדגים את התאים ואת החלק העליון של ממбраסת הסיליקון. אתר תאים פרוסים היטב עם גרעינים הממוקמים במרכז.

השיגו תמונת ניגודיות פנים (face contrast), שצריכה להתמקד במתווה התא ובממברנת הסיליקון. לאחר מכן, השיגו תמונת פלואורסצנציה של צביעת ה-nu nuclear hook, שצריכה להתמקד במישור המרכזי של הגרעין. לאחר השגת תמונות של חמישה עד 15 תאים, חזרו לנקודה המרכזית.

הפעיל באיטיות את המשקל על תבנית המתיחה כדי להבטיח הפעלת מאמץ אחידה במרכז התבנית. המאמץ המקסימלי המופעל על התשתית מוגבל על ידי ספייסרים מניילון המוצבים על פיני היישור האנכיים. לאחר הפעלת המאמץ, התמקד בתחתית ממбраנת הסיליקון ואתר שוב את נקודת הייחוס, והתחל מהנקודה.

העתק את אותם התאים, ורכוש שוב תמונה בניגוד מופע (phase contrast) ותמונה פלואורסצנטית של כל תא בגרעין תחת מאמץ מלא, תוך ניסיון להתאים בדיוק את מישורי המיקוד של התמונות הראשוניות. תהליך זה לא יעלה על 10 דקות כדי למנוע רמיodeling פעיל והסתגלות של התא לסובסטרט הזר. לאחר רכישת כל התמונות התואמות, החזר את שולחן המיקרוסקופ לנקודת ההתחלה.

הסר בזהירות את המשקולת מלוח תמיכת הכלי ואפשר לממברנת הסיליקון להירגע במידת הצורך. דחף בעדינות למעלה את כלי הסינון עד שיחזור לעמדה הראשונית. לאחר מכן, בצע דגימה בניגוד פאזה ובפלוורסצנציה.

תמונות של התאים לאחר המתיחה, בדיוק כפי שמתואר עבור תמונות המתיחה, ותמונות של תאים וגרעינים המסומנים פלואורסצנטית לפני, במהלך ואחרי יישום המתיחה, מנותחות כדי לחשב את המתיחה הגרעינית הנורמלית. בהדגמה זו, נעשה שימוש בסקריפט MATLAB שנכתב במיוחד עבור הניתוח, אך קיימות מספר אפשרויות חלופיות לחישוב ידני של מתיחת התשתית המיושמת על ידי התאמת המיקומים של שלוש עד שש נקודות בקרה הממוקמות על הממברנה בין התמונות התואמות של לפני המתיחה ואחרי המתיחה המלאה. תוכנת ה-MATLAB מחשבת לאחר מכן את מתיחת הממברנה המיושמת על ידי השוואת המיקומים של נקודות הבקרה התואמות בין התמונות של לפני המתיחה ואלו של המתיחה המלאה.

המיקומים מושווים גם עבור המאמץ השארי בין התמונות שלפני המאמץ ואחרי המאמץ. נקודות הבקרה משמשות בו-זמנית לרישום זוגות התמונות, דבר שיסייע בזיהוי תאים פגומים או כאלה המתנתקים. לאחר מכן, יש לבחור גרעינים באופן ידני באמצעות תוכנית MATLAB נפרדת המחשבת את המאמץ הגרעיני עבור כל גרעין בנפרד.

דבר זה מושג על ידי התאמה של גודל הגרעין בין תמונות פלואורסצנציה תואמות שלפני המתיחה ואחריה, או על ידי התאמה של סמנים תוך-גרעיניים כדי לפצות על שינויים קטנים במתיחת הממברנה המופעלת בין ניסויים שונים. התוצאות מובאות כמעוות גרעינית מנורמלת. זו מוגדרת כיחס בין המעוות הגרעיני המושרה למעוות הממברנה המופעל שחושב עבור כל גרעין.

את סקריפטים של MATLAB ניתן לקבל ממעבדת lambing על פי בקשה. כשלב סופי, כל גרעין עובר תיקוף ומדידות מתאים שהתנתקו או ניזוקו במהלך הפעלת המתיחה מוחרגות. MEFs שנפרסו על שני אזורים נפרדים על ממבנה הסיליקון צולמו באמצעות מיקרוסקופיית ניגודיות מופזים (phase contrast) ומיקרוסקופיית פלואורסצנציה לפני, במהלך ואחרי הפעלת מתיחה צירית של 20%UNI; המוצג כאן הוא דוגמה לניסוי מוצלח עם גרעינים תקינים מתאים ששרדו את הפעלת המתיחה ללא נזק או התנתקות.

בניגוד לכך, התאים המוצגים כאן התכווצו או התנתקו חלקית במהלך הפעלת המתיחה והם מוחרגים מהניתוח. התא בצד שמאל מראה סימנים לנזק לשלד התא ולקריסה גרעינית, בעוד שהתא בצד ימין מתנתק חלקית ומתכווץ במהלך הפעלת המתיחה. דבר זה עשוי להוות אינדיקציה למתיחה מופרזת.

כאן מוצג ניתוח של מאמץ גרעיני מנורמל בפאנל של קווי תאי meth שונים מעכברים חסרי Lamin AC, כאשר התאים מבטאים באופן אקטופי וקטור ריק או lamin A מסוג בר (wild type) בהשוואה לתאים מאחים למשגרה מסוג בר. אובדן הביטוי של חלבוני מעטפת הגרעין Lamin AC גורם לעלייה במאמץ הגרעיני המנורמל. הדבר מעיד על ירידה בנוקשות הגרעין, שניתן לשקם באופן חלקי או מלא על ידי הכנסה מחדש של Lamin A מסוג בר. כדי להכין את הניסוי למניפולציה באמצעות מיקרו-מחט, הדגרו את כלי תרבית תאים עם תחתית זכוכית של 35 מילימטר עם ריכוז נמוך של פיברונקטין במשך שעתיים ב-37 °C; לאחר ההדגרה, שטפו את הכלי פעמיים ב-HBSS והוסיפו לכלי 2 מיליליטר של מצע גידול.

לאחר מכן, פיברובלסטים עובריים של עכבר עוברים עיכול בטריפסין בריכוז 0.05% ונזרעים במצע גידול על צלחית עם תחתית זכוכית מצופה פיברונקטין, בנפח של שני מיליליטר של מצע גידול. כדי להשיג תאים בודדים הדבקים שאינם במצב של התגבשות (non-confluent), מחזירים את התאים לאינקובטור למשך הלילה. לצורך צביעת התאים, מוסיפים צבע מיטוכונדריאלי Mitotracker וצבע גרעיני Hoechst למצע הגידול. מוסיפים מצע גידול זה לתאים וממשיכים בדגירה.

לאחר מכן, שטפו את התאים על ידי דגירה בתוך Hank's buffered salt saline למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הוסיפו לתאים מצע גידול ללא phenol red עם 25 millimolar HEPES לצורך הדמיה.

עבור ניסוי המיקרו-מחט, הכניסו מיקרו-מחט שנמתחה מבעוד מועד לתוך מיקרו-מניפולטור המחובר למיקרוסקופ הפוך עם מצלמה דיגיטלית מסוג CCD (charge coupled device). מצעו את המיקרו-מחט בקרבת תא בודד. רכשו תמונה אחת של התא הבודד ללא המיקרו-מחט המוחדרת אל השלד התאי (cytoskeleton).

בניגודיות פאזה, צלם תמונה פלואורסצנטית אחת של צביעות hooks 3 3, 3 4 2 ותמונה פלואורסצנטית אחת של צביעת המיטוכונדריה עם עדשה פי 60 במיקרוסקופ הפוך. באמצעות המיקרו-מניפולטור, הכנס בזהירות את המיקרו-מחט לתוך הציטופלזמה של תא במרחק קבוע מהיקף הגרעין, וצלם תמונה אחת בניגודיות פאזה, תמונה פלואורסצנטית אחת של צביעות hooks 3 3, 3 4, 2 ותמונה פלואורסצנטית אחת של צביעת המיטוכונדריה. העבר את המיקרו-מחט למרחק ספציפי לעבר היקף התא במהירות של 1 µm לשנייה, באמצעות המיקרו-מניפולטור המונחה במחשב, תוך רכישה אוטומטית של תמונות בכל 10 שניות.

בעוד שהמיקרו-מחט נעה למרחק ספציפי לעבר פריפרית התא, יש לשלוט במיקרו-מניפולטור באמצעות מחשב כדי להשיג מיקרו-מניפולציה עקבית. הפרוצדורות מסתיימות ברכישת תמונות לאחר הסרת המיקרו-מחט; תמונות של הציטושלטון ושל מאפיינים מסומנים פלואורסצנטית של הגרעין והציטושלטון, שנרכשו לפני, במהלך ואחרי המניפולציה במיקרו-מחט, מנותחות כדי לחשב את ההעתקה של אזורים תוך-תאיים קטנים. בהדגמה זו, נעשה שימוש בסקריפט MATLAB שנכתב באופן מותאם לצורך האנליזה, אך קיימות מספר אפשרויות אחרות.

ניתן לקבל את סקריפט ה-MATLAB ממעבדת lambing לפי בקשה, לצורך מדידת העתק המיקום שנוצר על ידי המיקרו-מחט. תוכנת ה-MATLAB משתמשת באלגוריתם של מתאם הצלבה מנורמל (normalized cross correlation) כדי לחשב את ההיסט בין המיקום המקורי של המאפיינים המסומנים פלואורסצנטית לבין מיקומם המזוהה מחדש. ההעתקים מוצגים לאחר מכן כמיפויי וקטורים ונשמרים כערכים מספריים.

השלב הבא הוא שימוש במפות וקטורי ההעתקה שהתקבלו כדי לקבוע את ההעתקות הממוצעות בתוך השלד התאי או הגרעין באמצעות matlab. ראשית, בחרו שלוש נקודות או יותר בתוך השלד התאי באתר הפעלת המאמץ. במפת וקטורי ההעתקה, חשבו את הערך המספרי הממוצע כדי לקבוע את מידת המאמץ של השלד התאי סמוך לאתר ההפעלה שנוצר במהלך יישום המיקרו-מחט.

בשלב הבא, בחרו שלוש נקודות או יותר בתוך הגרעין בסמוך לאתר הפעלת המאמץ וחשבו את ערך הממוצע. ערך זה מייצג את כמות המאמץ הגרעיני בסמוך לאתר יישום המיקרו-מחט. באמצעות אותה שיטה, קבעו את המאמץ הגרעיני ואת המאמץ השלדי של התא הרחוקים מאתר הפעלת המאמץ, על ידי בחירת נקודות באזורים אלו.

נערך ניסוי מניפולציה של מיקרו-מחט למדידת העברת כוחות תוך-תאיים. מוצגים כאן תמונות בניגוד מופע (phase contrast) ותמונות פלואורסצנציה של פיברובלסט המסומן בצבע גרעיני כחול ובצבע מיטוכונדריאלי MIT tracker green. מיקרו-מחט הוכנסה לתוך השלד התאי במרחק מוגדר מהגרעין ולאחר מכן הונעה לעבר פריפרית התא.

מיקומי המיטוכונדריה נמדדו לפני, במהלך ואחרי מאמץ של השלד התאי, ולאחר מכן הוצגו התזוזות כווקטורים. כל ווקטור מייצג את התזוזה שחושבה כהפרש בין המיקום המקורי למיקום החדש שזוהה. אזורים בעלי עוצמת תמונה נמוכה או מרקם לא מספיק הוצאו מהניתוח.

לאחר מכן כמתה את ההעתקה של השלד התאי והגרעין באזורים נבחרים במרחקים גדלים מאתר הפעלת המתיחה, הן עבור פיברובלסטים של ביקורת והן עבור פיברובלסטים. בתאים בעלי צימוד גרעין-שלד תאי תקין, כוחות מועברים דרך התא כולו, מה שגורם לעיוות מושרה של הגרעין והשלד התאי שנחלש בהדרגה ככל שמתרחקים מאתר הפעלת המתיחה. לעומת זאת, תאים בעלי צימוד גרעין-שלד תאי פגום מראים העתקה מקומית בקרבת אתר ההפעלה ורק עיוות מושרה מועט במרחק רב יותר.

הפעלת מאמץ ציטושלטי דומה נצפתה באתר החדרת המיקרו-מחטים הן בפיברובלסטים של הביקורת והן בפיברובלסטים עם צימוד גרעיני-ציטושלטי משובש. עם זאת, העתקה גרעינית וציטושלטית שהשראה באזורים אחרים הייתה קטנה באופן משמעותי בפיברובלסטים עם צימוד גרעיני-ציטושלטי משובש מאשר בתאי ביקורת. לפיכך, ירידה בהעתקה של השלד התאי והגרעין הרחק מאתר הפעלת המאמץ מעידה על כך שההעברה הכפויה בין השלד התאי לגרעין הופרה.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן למדוד מכניקה גרעינית והעברה של כוחות תוך-תאיים בין הגרעין לשלד התא. ניתן להשתמש בטכניקות אלו כדי לחקור את ההשפעה של מוטציות בחלבונים של מעטפת הגרעין, או שינויים בהרכבה של מעטפת הגרעין המתרחשים במהלך ההתפתחות או במצבי סרטן.