רגישות בדיקת Antimicrobial של קומפלקס שחפת Mycobacterium עבור תרופות הקו הראשון והשני על ידי דילול מרק בפורמט פלייט microtiter

קיימות מעט תרופות זמינות לטיפול ב-mycobacterium tuberculosis, ולכן עמידות לכל תרופה היא מקור לדאגה. מאמר וידאו זה מתאר פרוצדורה לבדיקת העמידות של M tuberculosis ל-12 תרופות אנטי-מיקרוביאליות שונות בו-זמנית. לפיכך, היכולת לזהות במהירות עמידות אנטי-מיקרוביאלית של M tuberculosis היא חשובה מאוד במאמץ לבקר את העלייה בזנים עמידים, וכאן נבחן את הרגישות לאנטיביוטיקה.

ראשית גדלים את M tuberculosis על מצע מוצק או במצע צח, עד לקבלת תרחיף חיידקים. מכינים את האינוקולום ומוסיפים אותו ללוחית מיקרוטיטר המכילה ריכוזים שונים של 12 תרופות, כולל תרופות קו ראשון וקו שני. לאחר האינקובציה, נקבעת מידת הצמיחה בכל באר באופן ידני באמצעות קופסת מראות או באמצעות קורא לוחות חצי-אוטומטי.

הנתונים המתקבלים מצביעים על הריכוז המעכב המינימלי עבור כל תרופה שנבדקה ומראים לאילו אנטיביוטיקות השבט הנבדק של TB עמיד. תוצאות אלו מסייעות בבחירת התרופה המתאימה לטיפול ב-tb. שלום, שמי ננסי אק ואני מנהלת מעבדת המיקובקטריולוגיה במאיו קליניק ברוצ'סטר, מינסוטה.

היום נתאר שיטה לביצוע בדיקת רגישות לאנטיביוטיקה עבור mycobacterium tuberculosis. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון דילול במצע נוזלי (macro broth dilution), הוא שערך ה-MIC נקבע עבור כל תרופה ו-12 אנטיביוטיקה נבדקים בו-זמנית. את הפרוצדורה יעשׂה קורט ג'וד, מומחה איכות במעבדה שלי, בעת עבודה על שולחן מעבדה.

הכינו את הפרוצדורה על ידי סימון של צלחת אגר דם, שלוש צלחות Middlebrooks 7H10, מבחנה עם חרוזי זכוכית המכילה saline tween, וצלחת מיקרוטיטר בשם המטופל ובמספר זיהוי הדגימה. בנוסף, סמנו את צלחת אגר הדם ואת צלחות ה-7H10 כ-"purity" (בדיקת טוהר). סמנו את אחת מצלחות ה-7H10 כ-"one to one colony count" ואת השנייה כ-"one to 50 colony count".

לאחר מכן, הניחו את המגש במעבר (pass through). כעת, היערכו לעבודה במעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 3 (BSL three) על ידי לבישת חלוק בעל חזית סגורה, כיסוי ראש, כפפות, כיסויי נעליים ומסכת נשימה. במקרה זה, נעשה שימוש במסכת נשימה מסוג PAPR.

לאחר מכן, הוציאו את המגש מהחלון למעבר. בשלב הבא, בתוך מתקן ה-BSL 3, חטאו את פני השטח של קבסינט הבטיחות הביולוגית. לאחר מכן, הניחו בתוך המנדף נייר סופג ספוג בחומר חיטוי, במרחק של כשישה אינצ'ים מלוח פתחי האוורור שליד הנייר הסופג.

הניחו לולאותe接 chủng (inoculating loops), פיפטורים וטיפים, מכל פסולת מתאים, nephi, TER וורטקס. לאחר הכנת המנדף, הניחו את האורגניזם על נייר סופג יחד עם מעמד הכולל סטנדרט McFarland 0.5, ציר H7H9 עם OADC ומבחנה עם חרוזי מלח. הגדרה זו מבוצעת ממצע מוצק.

הכינו אינוקולום מתרבית של מצע מוצק מדגימה של מטופל. השתמשו בלולאה סטרילית כדי לגרד את המושבות ולהעבירן לשפופרת זכוכית עם חרוזי זכוכית המכילה saline tween. ערבבו את התמיסות באמצעות vortex למשך 30 עד 60 שניות.

בצעו בדיקה חזותית של הדגימה והשוו אותה לתקן McFarland. הכמות שהועברה צריכה להיות שווה או גדולה מזו של התקן. אם לא, הוסיפו עוד מהדגימה הבקטריאלית ושנו שוב ב-vortex.

לאחר התאמה לתקן McFarland, יש להמתין 15 דקות להשקעת האינוקולום כדי לאפשר לגושים גדולים יותר של חיידקים לשקוע. לאחר מכן, השתמש ב-nefi TER כדי למדוד את צפיפות החיידקים התלויים לאפס. ה-nephi ter.

ראשית, הניחו מבחנה עם חרוץ מלח פיזיולוגי ריק בתוך ה-nephi ter. לחצו על כפתור הכיול (calibrate) כדי לאפס את המכשיר, ולאחר מכן הניחו את סטנדרט McFarland 0.5 ב-Nephi ter ולחצו שוב על כפתור הכיול. ברגע שהמכשיר כויל, הוציאו את סטנדרט McFarland והכניסו את האינוקולום.

קריאת האינוקולום צריכה להיות שווה לקריאת תקן מקפארלנד (McFarland). אם הקריאה נמוכה מדי, הוציאו את המבחנה והעבירו חיידקים נוספים מהצלחת. לאחר מכן, ערבבו בוורטקס וקראו את הדגימה שוב.

אם הקריאה גבוהה מדי, הוסיפו saline tween למבחנה ושקשקו במערבל vortex. לאחר מכן, קראו שוב את הדגימה. המשיכו להתאים את התמיסה המזהמה (inoculum) לפי הצורך עד שריכוז החיידקים יתאים לתקן McFarland.

בשלב הבא, השתמשו בפיפטור של 200 µL ובטיפ פיפטה ארוך עמיד לארסול כדי להוציא 100 µL מהאינוקולום מהשליש העליון של המבחנה. כדי למנוע גושים ששוקעים לתחתית ציר Middlebrook 7H9, ערבלו את ציר האינוקולום באיטיות במכשיר וורטקס למשך 20 שניות לפני זריעת האינוקולום. התחילו בהוצאת פלטת המיקרוטיטר מאריזת היצרן. אם החומר מייבש כחול או אם אריזת הרדיד פגומה, אין להשתמש בה.

הפלטה כבר מכילה את 12 האנטימיקרוביאליים לבדיקה בכל באר, כולל התרופות היעילות ביותר או תרופות קו ראשון ותרופות קו שני. שפכו בזהירות את אינוקולום ה-H nine broth לתוך מבחנה, תוך הקפדה שלא להיווצר אירוסולים. לאחר מכן, הניחו את פלטת המיקרו-טיטר כך שהתווית פונה החוצה כפי שמוצג כאן, והשתמשו בפיפט 12 ערוצים כדי להוסיף 100 µL של האינוקולום לכל באר.

בשלב הבא, הכינו את הצלחות לביצוע ספירת מושבות. ראשית, הכינו צלחת ללא דילול על ידי העברת לולאה של 1 µL מהדגימה שבבאר הביקורת החיובית אל צלחת H 10 המסומנת כ-1:1. לאחר מכן, השתמשו בלולאה כדי לזרוע את הצלחת כפי שמוצג כאן.

בשלב הבא, להכנת דילול של 1:50, העבירו לולאת מיקרוליטר אחד מבאר ביקורת החיובי וערבבו אותה בתוך מבחנה המכילה 50 µL מים. זרעו מיקרוליטר אחד מדילול זה על פלטה המסומנת ב-1:50. זרעו את פלטות הבדיקה לטוהר על ידי פיפטור של 50 µL מהאינוקולום מהתרבית אל פלטות blood agar ו-7H10 המסומנות כראוי, ובצעו מריחה לבידוד.

לאחר מכן, הניחו trth נוסף מעל ה-trth שהוחדר וסידרו אותם בעדינות במיכל הפסולת. הניחו מדבקת איטום על לוח המיקרוטיטר. לאחר מכן, בעזרת הגב הלבן, לחצו בחוזקה על כל באר כדי להבטיח איטום נאות, וודאו שאין קפלים.

חטא את פלטת המיקרוטיטר על ידי ניגוחה בנייר סופג הספוג בחומר חיטוי קוטל-שחפת (tuberculocidal). לאחר מכן, הכנס את פלטת המיקרוטיטר לשקית פלסטיק וסגור אותה באמצעות חום (heat seal). לבסוף, חטא את כל החומרים, כולל הפיפטות, הוורטקס, הפלטות והמבחנות, על ידי ניגוחם בחומר חיטוי קוטל-שחפת.

כאן משתמשים ב-pro spray לאחר שעבר מספיק זמן כדי להבטיח חיטוי. 15 דקות עבור pro spray. הצלחות נסגרות בעזרת סרט הדבקה (scotch tape), מוכנסות לשקיות פלסטיק, וציוד אטום מוצא מקללת הבטיחות הביולוגית ומועבר לתא המעבר (pass through).

בשלב זה יש לסגור ולאטום את שק הפסולת האדום באמצעות קשירה, ולהסיר את הגלימה, כיסויי הנעליים והכפפות. לאחר מעבר לחדר ההכנה (ante room) ושטיפת ידיים, יש להסיר את מסכת הנשימה, לחטא אותה ולאחסנה; לאחר שטיפת ידיים נוספת, יש ללבוש גלימה נקייה ולעזוב את מתחם ה-BSL three. לאחר מכן, יש לבצע עיקור באוטוקלאב למכל הפסולת.

לאחר מכן, הדגרירו את פלטת המיקרוטיטר ואת שבע פלטות ה-H 10 ו-blood auger כשהן פונות כלפי מעלה באינקובטור בטמפרטורה של 35 עד 37 °C עם 5 עד 10% CO2 במעבדת BSL 2. הדבר מקובל כיוון שהפלטה אטומה היטב ונמצאת בתוך שקית פלסטיק. זמן הדור של *Mycobacterium tuberculosis* הוא כ-12 עד 24 שעות, ולכן יעבור שבוע לפחות עד שניתן יהיה להבחין בצמיחה כהיווצרות של משקע תאים בתחתית באר הביקורת. ביום ה-10, בצעו קריאה ידנית במכשיר ה-MIRR על ידי הנחת פלטת המיקרוטיטר ה-AST האטומה על פלטפורמת תיבת ה-MIRR.

השתמשו במנורת שולחן כדי לסייע בוויזואליזציה של הצמיחה, והתאימו את המיקום לפי הצורך כדי לקבל את הניגודיות הטובה ביותר. בדקו את בארות בקרת הצמיחה, במקרה זה H 11 ו-H 12, על ידי התבוננות במראה. אם ישנה צמיחה, הבארה תיראה עכורה או שתיראה כבעלת משקעים, כפי שמוצג כאן.

אם לא נצפתה צמיחה כפי שמוצג בדוגמה זו, הבאר תיראה שקופה. במקרה זה, החזירו את הפלטה למדגרה והמשיכו בדגירה למשך עד 21 ימים. עבור כל תנאי, השוו את הצמיחה לבקרת הניסוי.

אם כן, עבור כל רשומת תרופה, הדילול הראשון שאינו מראה צמיחה הוא הריכוז המעכב המינימלי, או ה-MIC, של התרופה. כדי לבחון תוצאות באמצעות קורא לוחיות אוטומטי כגון ה-vision, התחילו בפתיחת תוכנת ה-Myco TB a ST plate וביצוע התחברות. הניחו את הלוחית האטומה כאשר הברקוד פונה החוצה. כפי שמוצג כאן, צמיחה נראית כעכירות או כמשקע של תאים בתחתית הבאר על מסך המחשב.

ראשית, יש לבחון את בישורי הצמיחה, כפי שנעשה קודם לכן. אם לא נצפתה צמיחה, יש להחזיר את הפיתה למדגרה למשך תקופה של עד 21 ימים.

אם התוצאה חיובית, רשמו את התוצאות על ידי לחיצה על המסך על הבאר הראשונה שאינה מראה צמיחה עבור כל תרופה. במקרים מסוימים, חיידקים, משקעים או תרופות שוקעים לתחתית הבאר. תופעה זו, המכונה trailing, מזוהה על ידי מספר בארות עם משקע בגודל זהה ואינה נחשבת למעשה לצמיחה חיובית.

בשלב הבא, בוחנים את שבעה מובילי ה-H 10 ואת צלחות האגר דם כדי לקבוע את הריכוזים החיידקיים ולהעריך את הטוהר. בצלחת אגר הדם לא אמור להופיע גדילה לאחר 48 שעות. גדילה בצלחת אגר הדם מעידה על זיהומים של חיידקים בעלי קצב גדילה מהיר.

במידה וישנו גדילה, יש לחזור על בדיקת המיקרוטיטר. בצלחת בדיקת הטוהר H 10 צריכה להיות גדילה של אורגניזם אחד. זן EM tuberculosis צריך להופיע בצבע בז', מקומט וחספס. במקרה של זיהום, יש לחזור על בדיקת המיקרוטיטר מתרבית טהורה.

כדי להעריך את ריכוז החיידקים, ספרו את המושבות על פלטת ה-H 10 השביעית. לאחר מכן, באמצעות הטבלה במסמך הכתוב המצורף, חשבו את מספר המושבות. Mycobacterium tuberculosis גודל מדגם של מטופל והעמידות לאנטיביוטיקה הוערכה כפי שמתואר בסרטון זה; בפלטה המוצגת כאן, קיימים 12 תרופות שונות בריכוזים עולים, כאשר הריכוזים הגבוהים ביותר נמצאים למעלה והריכוזים הנמוכים ביותר למטה.

הריכוז המעכב המינימלי, או MIC של התרופה, התוווה לריכוז הנמוך ביותר של התרופה שלא הראה צמיחה כלל, והוא מסומן במעגל בתמונה המוצגת כאן, בהתאם לנקודות חיתוך סטנדרטיות שנקבעו על ידי ה-Clinical and Laboratory Standards Institute. הנתונים המוצגים כאן מצביעים על כך שזן TB זה יהיה עמיד ל-Isid ול-Rifampin. במבחנה (In vitro), ערכי ה-mics הגבוהים שנצפו במספר תרופות אחרות, כולל oin, moxifloxacin, streptomycin ו-rifabutin, מצביעים על עמידותו של זן ה-EM tuberculosis לסוכנים אלו.

יש להשתמש בתוצאות ה-MIC על ידי מומחה למחלות זיהומיות בעל ניסיון בטיפול בשחפת לצורך פיתוח תוכנית טיפול אישית. לאחר רכישת מיומנות, הכנת בידוד אחד בשיטה זו אורכת כ-40 דקות. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי מדובר בפתוגן נשימתי וכי אין לייצר אירוסולים. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של אופן ביצוע בדיקת רגישות לאנטימיקרוביאליים עבור mycobacterium tuberculosis באמצעות שיטת דילול במיצואי צח (micro broth dilution). זכרו כי עבודה עם mycobacterium tuberculosis עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון הגנה נשימתית, במקום שבו הדבר נדרש.