השימוש מלכודת אופטית לחקר מארח הפתוגן אינטראקציות עבור הדמיה דינמי תא חי

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להשתמש במלכודת אופטית בשילוב עם מיקרוסקופיה קונפוקלית של דיסק מסתובב (spinning disc confocal microscopy) כדי לצפות באינטראקציות בין מאכסן לפתוגן בזמן אמת. דבר זה מושג תחילה על ידי הוספת הפתוגנים הרלוונטיים לזכוכית כיסוי עם תא. לאחר מכן, נבחר חלקיק ונלכד באמצעות המלכודת האופטית.

לבסוף, החלקיק מופנה אל התא הנבדק. כפי שנראה כאן. לכידה אופטית יכולה להיות שיטה יעילה לשליטה בשני חלקיקים לצורך תצפית על אינטראקציות תוך-תאיות דינמיות.

שיטה זו יכולה לענות על שאלות חשובות בנוגע לאינטראקציות בין מאח ופתוגן בתחומי המחלות הזיהומיות והאימונולוגיה, כולל מהי ההשפעה על הפגוציטוזה כאשר מושג שליטה מלאה על היחסים המרחביים בין תאי המאח לפתוגנים, וכן האם לסדר קליטת הפתוגנים על ידי תא פגוציטי יש השפעה על הבשלת הפגוזום. באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את השיטה יתקשו בביצועה, כיוון שיש לייעל את תנאי הלכידה עבור סוגים שונים של תאים וחרוזים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, שכן התהליך כולל הגדרה ואינטגרציה של דיסקה מסתובבת (spinning disc).

קשה להמשיג את העיקרון של מיקוד קונפוקאלי למלכודת אופטית בשל הכיוון המדויק הנדרש עבור כל הרכיבים האופטיים. אספו את הפתוגן הרלוונטי. לדוגמה, כאן, מוציאים מהתרבית 300 µL של *Candida albicans* שגודל בן לילה במצע נוזלי ומעבירים את הפתוגנים למבחנה לתגובה בנפח 1.5 mL.

לאחר מכן, שטפו את הפתוגנים שלוש פעמים בערך ב-1300 Gs למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, תוך שאיבת העליון והשארת המשקע ללא הפרעה בכל פעם עם PBS שסוספנדו מחדש וביצוע סוניקציה. לאחר השטיפה השלישית, סספנדו מחדש את המשקע ב-500 µL של PBS. לאחר מכן, המיסו מיליגרם אחד של צבע ה-entrust ב-100 µL של dimethylformamide כדי להגיע לריכוז סופי של 10 mg/mL.

לאחר מכן, הוסיפו 3 µL מתערובת הצבע לשפופרת התגובה המכילה את הפתוגנים הרחוצים. עטפו את השפופרות בנייר אלומיניום מכיוון שהצבעים רגישים לאור, ונקנעו את הדגימה בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת; לאחר מכן, השקיעו ושטפו את הדגימה ב-PBS שלוש פעמים כפי שנעשה קודם לכן. לאחר השטיפה האחרונה, השביעו את המשקע ב-300 µL של PBS.

חממו את התווך המכיל טריפסין ו-PVS ל-37 degrees Celsius במקלחית. שטפו פלטת תרבית רקמות של 10 סנטימטרים המצופה בתאי מאקרופגים RAW 264.7 פעמיים באמצעות PBS, תוך שאיבת ה-PBS בין שטיפה לשטיפה. לאחר מכן, כסו את פני הפלטה ב-5 milliliters של טריפסין והדגרו את הפלטה למשך חמש דקות ב-37 degrees Celsius.

לאחר מכן, הקישו בעדינות על דופן הצלחת כדי לנתק את התאים מפני השטח של הצלחת, תוך הקפדה לא להתיז את ה-trypsin מחוץ לצלחת. כעת, הוסיפו חמישה מיליליטר (5 mL) של מצע גידול לצלחת והעבירו את התערובת למבחנה.

לאחר סבב הצנטריפוגה, שאפו את המצע תוך הקפדה שלא להפריע למשקע, ותוהלו את המשקע ב-10 milliliters של מצע. הוסיפו 400 microliters של מצע לכל תא של שקופית תאים (chamber slide), ולאחר מכן הוסיפו חמישה microliters של תגלי התאים לכל תא. אפשרו לתאים לגדול למשך לילה במדגרה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius עם 5%CO2.

הוציאו את שקופית התאיים מהאינקובטור והעבירו באמצעות פיפטה 5 עד 10 µL של הפתוגנים המסומנים פלואורסצנטית שהוכנו מראש לתוך כל תא של מקרופאגים. ערבבו היטב את המקרופאגים והפתוגנים על ידי פיפוט למעלה ולמטה, תוך הקפדה לא לגעת בתחתית התא כדי לא להפריע למקרופאגים ההדבקים. הדליקו את כל רכיבי המיקרוסקופ הקונפוקאלי עם הדיסקה המסתובבת.

הכינו את המיקרוסקופ על ידי הוספת שמן לעדשת השקיעה בשמן (oil immersion objective lens). הכניסו את שקופית התא למבנה המבנה המיוחד ולאחר מכן הסירו את החלק העליון של שקופית התא וכווניו את המיקרוסקופ לצילום ב-DIC. הפעילו את התריס עבור המלכודת האופטית ואת לייזר ה-IR.

לאחר מכן, פתח את התריס של הלייזר המופנה למלכודת האופטית. ודא שהתריס שלפני לייזר ה-IR סגור באמצעות בדיקה עם כרטיס IR. כעת, התמקד במקרופאגים על השקופית שעליה הם נצמדו.

לאחר מכן, חפשו את הפתוגנים הצפים בחופשיות בתמיסה הסמוכים למקרופאגים. החלק הקשה ביותר בהליך זה הוא מציאת האובייקט המתאים למעקב בתא הדגימה, וזאת עקב כוחות ההיצמדות בין האובייקט לזכוכית הכיסוי בתא הדגימה. כדי להזיז את האובייקט, עליכם להזיז את השולחן בזמן שהאובייקט מוחזק על ידי לייזר התנועה, וחשוב לציין כי עליכם להזיז את השולחן במהירות נמוכה מספיק, כך שכוח הגרירה של השולחן לא יעלה על כוח הלכידה המקסימלי של המלכודת.

הזז את השולחן כך שהפתוגן יהיה בסביבת המלכודת. לאחר מכן, פתח את התריס והפעל את המלכודת. הזז את הדגימה כדי להבאת המקרופאגים למגע עם תמונה נייחת של פתוגן שנלכד.

הפתוגנים תחת מיקרוסקופ קונפוקלי בעל דיסק מסתובב, הן ב-DIC fluorescence או בשילוב של שניהם, אושלו באפור, כחול ואדום עבור אוכלוסיות נפרדות של Canada albicans, שגודלן בדרך כלל כ-חמישה מיקרונים. כדי להדגים את הדמיית הדימיון, תא בודד של C albicans נלכד והוזז בתבנית ריבועית דרך צבר של שמרים אחרים, כפי שמסומן על ידי החצים האפורים, מה שמדגים את היכולת ללכוד ולשלוט במיקום ספציפי של פתוגן בודד שנבחר על ידי המפעיל, אפילו בסביבה צפופה. כדי להדגים עוד יותר את הגמישות של מערכת זו ללכוד מורפולוגיות של צורות שונות המוצגות על ידי אורגניזמים פתוגניים בדמות, נעשה שימוש בפינצטה אופטית כדי להחזיק ולמקם חלקיק C albicans עם pseudo hyphy.

ה-C albicans מסומן בצבע אדום ומונע לאורך מסלול כפי שמתואר על ידי החץ הלבן, ומוצב לצד תאי GFPL C3 raw פלואורסצנטיים. בירוק. חלק השמרים של ה-albicans נלכד בעוד שהפסאודוהיפה (pseudo hypha) נמתחה לאורכו.

הפטרייה *Aspergillus fumigatus* מוקמה גם לצד תא מקרופאג של עכבר במצב גולמי, וזאת כדי לנתח את מסגרת הזמן המוחלטת של הפגוציטוזה עם שורת התאים והפתוגן הספציפיים הללו. בדמות זו, תמונות בשדה בהיר מראות כיצד ה-aspergillus שנלכד, כפי שמצוין על ידי החץ הלבן, הועבר והוצב לאורך הנתיב המצוין על ידי החץ האדום. הפתוגן הלכוד אינו נמצא במיקוד מלא בשל כך שהמלכוד דחף את האורגניזם מעט מעל למישור המוקד.

ה-Aspergillus הובא עד שהוצב בסמיכות לתא הגולמי הרצוי. ברגע שהפתוגן יצר מגע עם התא, המלכוד הופסק. תהליך הפגוציטוזה הופעל והשתמשו בדימות מסוג time-lapse כדי לצפות באירועים התאיים שבאו בעקבות זאת.

בשנייה ה-30, ממברנת התא הגולמי החלה להשתנות וליצור גביע סביב החלקיק. בשנייה ה-60, הגביע היה גבוש לחלוטין. מהשנייה ה-90 ועד השנייה ה-150, ה-Afu Gotti נבלע, ובשנייה ה-180 החלקיק כבר הופנם במלואו.

לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה על האופן שבו ניתן להקים מערך של מלכודת אופטית בעלת דיסק מסתובב, וכיצד מכשיר כזה מאפשר שליטה לא-פולשנית בפתוגנים לצורך דימוי תאים חיים לאחר פיתוחו. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום האינטראקציות בין מאח ופתוגן לבחון את תפקידם של קשרים מרחביים בין תאי המאח לפתוגנים, ואת תפקידם בתגובה החיסונית בעקבות זאת.