שימוש במודל EpiAirway לאפיון לטווח ארוך מארח הפתוגן אינטראקציות

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבצע תרבית משותפת (co-culture) ארוכת טווח של Nontypeable Hemophilus influenza או NTHI עם רקמות אפיתליאליות נשימתיות ראשוניות של בני אדם באמצעות מודל epi airway. מטרה זו מושגת על ידיe חדרת NTHI למשטח האפיקלי, כדי לאפשר לחיידקים להיצמד לרקמות ולהחדיר עצמן אליהן כשלב שני. את הסבבים (inserts) שוטפים מדי 24 שעות ב-DPBS מחומם מראש כדי לדמות זרימת ריר רגילה ולהסיר תוצרי פסולת של מוצין ושאריות תאיות.

בשלב הבא, הרקמות נאספות בנקודת הזמן הרצויה ונמדדת ההישרדות של NTHI, בין אם בתאים המקושרים באופן כולל ובין אם בתוך התאים. לבסוף, באמצעות שיטה זו, ניתן להעריך מאפיינים ספציפיים לזן של הישרדות NTHI בתוך הרקמות לאורך זמן, בהתבסס על ספירת חיידקים חיים. שיטה זו עשויה לספק תובנות לגבי זיהומים ארוכי טווח של nontypeable hemophilus influenza.

ניתן להשתמש בשיטה זו גם בחקר פתוגנים אנושיים אחרים כגון Moraxella Alis. הפרוצדורה המוצגת בווידאו בוצעה על ידי ד"ר Doin, עמית פוסט-דוקטורט במעבדתי. הוצא את פלטת ההובלה מאריזתה והכן את הציוד לתחילת הניסוי. רסס את פלטת ההובלה ב-70% ethanol והנח את הפלטה בתוך תא הבטיחות הביולוגית.

העבירו מנה של 1 mL של מצע תחזוקה עבור epi airways, בטמפרטורה של 4 °C, לכל באר בלוחית בעלת שישה בארות. לאחר מכן, הסירו את הסרט, פתחו את הלוחית והסירו את הגזה המכסה את תבתי ה-epi airway. באמצעות תנועת סיבוב, השתמשו בפינצטה כדי לשחרר תבת מה-aros.

מקמו את המדף (insert) באחת מבארות הפלטה בעלת שש הבארות במידת הצורך. השתמשו במקלון צמר סטרילי כדי להסיר בזהירות את השאריות מהמדף, תוך הימנעות ממגע עם הממברנה. ודאו שאין בועות אוויר כלואות מתחת למדפים.

לאחר מכן, מקמי את הפלטה בעלת ששת הבארים באינקובטור. שטפי את התבתי ההכנסה (inserts) מדי יום באופן הבא: חממי מראש DPBS עם סידן ומגנזיום, ומלאי פיפטה ב-DPBS. לאחר מכן, באמצעות פינצטה סטרילית, הרימי בעדינות תבת הכנסה וטפטפי 200 µL של ה-DPBS המחומם על הרקמה.

לאחר מכן, נערו את המבנית (insert) כדי להפיץ את ה-DPBS באופן שווה מבלי לגעת ברקמה. לאחר מכן, הטו את המבנית בזווית והניחו קצה של פיפט P 1000 כנגד טבעת הפלסטיק המחזיקה את הממברנה בתחתית המבנית. לאחר מכן, שאבו בזהירות את תמיסת הבאפר והעבירו את התמיסה למבחנת קריו (cryo tube) לצורך מחקר בהמשך.

לבסוף, שאבו את מצע התחזוקה הבסיסי והחליפו אותו ב-1 mL של מצע טרי. חממו מראש כמות נוספת של DPBS עם סידן ומגנזיום. הוסיפו 3 mL של DPBS המחומם מראש לשפופרת של 15 mL, ולאחר מכן השעו לשפופרת מושבות בודדות של nontypeable influenza או NTHI שגודלו במהלך הלילה על אגר שוקולד.

כעת ערבבו את המבחנה במיקסר וורטקס (vortex) בעוצמה למשך 10 שניות לפחות, ולאחר מכן מדדו את הצפיפות האופטית. המשיכו להוסיף מושבות בודדות של NTHI עד שריכוז החיידקים יגיע ל-OD 600 nanometers של כ-0.7. לאחר מכן, שטפו כל סרט EPI airway ב-DPBS שחומם מראש כפי שנעשה קודם לכן, והוסיפו 28 µL של תמיסת החיידקים למשטח האפיקלי של כל סרט.

הימנעו מהחדרת החיידקים למצע התחזוקה הבסיסי. לאחר מכן, החזירו את הצלחת לאינקובטור כדי לכמת את ה-NTHI; ראשית חממו מראש, ולאחר מכן ייבשו את פני השטח של צלחות אגר שוקולד. לאחר מכן, בצעו דילול סדרתי של תמיסת ההחדרה של ה-NTHI באמצעות PBS סטרילי עם 0.1% ג'לטין או PBSG.

טפטפו מנות של 10 µL מהאינוקולום (tinoculum) על הצלחות, ולאחר מכן דגרו את הצלחות למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide. למחרת, קבעו את ה-CFUs למילליטר על ידי ספירת הדילול שבו יש 15 עד 30 מושבות נפרדות בכל טיפה, וחשבו חזרה אל האינוקולום החי בפועל של NTHI כדי לקצור את כל החיידקים הקשורים לתאים. שטפו את המשטח האפיקלי של ה-epi airways שלוש פעמים עם 200 µL של DPBS ללא סידן או מגנזיום.

לאחר מכן, הטו את המקורן (insert) ושטפו את שאריות מצע התחזוקה מהממברנה הבזאלית. הניחו את המקורן השטוף בפלטת שש בארות חדשה והוסיפו 250 µL של תמיסת saponin סטרילית בריכוז 1% על פני השטח האפיקליים של כל רקמה. החזירו את הפלטה לאינקובטור למשך 10 דקות לצורך דגירה.

הכינו מבחנות לדילול סדרתי על ידי מילוי כל מבחנת דילול ב-900 µL של PBSG. לאחר מכן, גרדו את הרקמה מהממברנה באמצעות טיפ של פפטת P 1000 בתנועות הלוך וחזור, ולאחר מכן בתנועות סיבוביות כדי להסיר את הרקמה מקצות האינסרט. לאחר מכן, באמצעות טיפ סטרילי בעל קוטר רחב של פפטת P 1000, העבירו את התרחוף למבחנת einor ריקה בנפח 1.5 mL.

כעת הוסיפו 250 µL של DPBS למשטח האפיקלי של המאסרט (insert), ולאחר מכן בחנו את המאסרט באמצעות מיקרוסקופ פאזה הפוך כדי לקבוע אם נותר רקמה לקציר. העבירו את התרחוף לפקתה (einor tube) והשלימו ל-500 µL של DPBS בערבוב נמרץ. ערבבו את תרחוף התאים בורטקס למשך דקה אחת.

לאחר מכן, באמצעות מזרק סטרילי של 1 mL המצויד במחט בקוטר 26 gauge, שאבו את התו сусפנזיה אל תוך המזרק דרך המחט. העבירו את הסספנזיה לאט דרך המחט שלוש פעמים, תוך הקפדה על אי-יצירת בועות.

לאחר מכן, ערבבו את התרחיף במיקסר (vortex) בעוצמה למשך דקה נוספת. בשלב הבא, השתמשו בטיפ פפטה בעל פתח רחב כדי להעביר 100 microliters מהתרחיף לנבובת הדילול הראשונה. ערבבו את הנבובת במיקסר בעוצמה למשך חמש שניות, ולאחר מכן בצעו דילול סדרתי של 1:10 והטילו את הדילול על צלחות אגר שוקולד.

לאחר מכן, דגרו את הצלחות למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C וב-5% carbon dioxide לצורך ספירת חיידקים חיוניים כדי לקצור חיידקים שהפנימו לתאים. שטפו כל insert שלוש פעמים עם 200 µL של DPBS. החליפו את מצע התחזוקה הבזאלי במצע המכיל 100 µg/mL של gentamycin sulfate, ולאחר מכן הוסיפו 300 µL של מצע התחזוקה המכיל Gentamycin על פני השטח האפיקליים.

החזירו את המinserts למדגרה למשך שעה אחת, ובזמן שהם מדגרים חממו מראש DPBS. לאחר מכן, הסירו את מצע התחזוקה המכיל Gentamycin מהמשטח האפיקלי. בשלב הבא, שטפו היטב את המשטח האפיקלי ואת הממברנה הבסאלית של ה-inserts באמצעות ה-DPBS שחומם מראש.

לבסוף, חזרו על הליך הקרצוף והאיסוף שהודגם זה עתה לפני ביצוע דילולות סדרתיות וזריעה של החיידקים שהפנימו בתמונה זו. השוואת תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק של רקמות דרכי נשימה epi שאינן נגועות משמאל, מול רקמות דרכי נשימה epi שנגעו ב-NTHI במשך חמישה ימים מימין. ניתן לראות שתיבית ארוכה עם NTHI אינה גורמת לנזק משמעותי לרקמות האפיקליות, מה שמדגיש את התועלת של מודל דרכי הנשימה epi.

כאן מוצג גרף המתאר את מספר חיידגיי ה-NTHI שהופנמו לאורך זמן במהלך תרבית משותפת (Co-culture) של דרכי נשימה אפיתליאליות. זן R 2 8 6 6 הוחדר בריכוז של כמעט one times 10 of the seventh CFU לכל סרט (insert). לאחר מכן, חיידקים שהופנמו נאספו ונספרו בכל נקודת זמן מצוינת.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של אופן ביצוע תרבית משותפת (co-culture) ארוכת טווח של NTHI עם רקמות נשימה הורמונליות ראשוניות באמצעות מודל A PRE.