הגדלת התשואות cDNA של תא בודד כמויות ה-mRNA בתקן Reverse transcriptase תגובות מעבדה באמצעות Microstreaming אקוסטית
11 ביולי 2011
אנו מתארים שיטה חדשה להגדלת התשואה cDNA של תא בודד של mRNA בכמויות ברמת אחרת הפוכה התגובות מעבדה שעתוק. החידוש מתגורר השימוש micromixer, אשר מנצל את התופעה של microstreaming אקוסטי, לערבב נוזלים בקני מידה microliter בצורה יעילה יותר מאשר רועד, vortexing או טחינה דקה.
פרוצדורה זו מגדילה את תנובת ה-CD NA מכמויות mRNA של תא בודד. התחילו בהשגת שיווי משקל של המיקרו-מיקסר בתוך אינקובטור המוגדר לטמפרטורת תגובת השעתוק ההפוך הרצויה. לאחר מכן, הגדירו תגובות RT סטנדרטיות במעבדה, הכוללות כמויות של RNA מתא בודד בנפחים של מיקרוליטרים.
מקם את מבחנת התגובה בביטחון בתוך חורי הערבוב, בחר את פרמטרי הערבוב המתאימים והפעל את ה-microm mixer. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בהליך זה כדי להשיג תנובות CDNA גבוהות יותר באמצעות qPCR כהכנה לתגובת ה-RT. הברא את ה-microm mixer באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך שעה אחת לפחות.
במבחנות PCR בעלות דופן דקה בנפח 200 µL, סטריליות ונטולות נוקלאז. הכינו את תגובות התעתוק ההפוך (reverse transcriptase) על פי הנחיות הספק, אך השתמשו בכמויות של RNA כולל המקוריות מתא בודד. כעת בחרו את התדר ואת האמפליטודה המתאימים של ערבוב המיקרו (microm mixing).
בשלב הבא, מקם את המבחנה בביטחון בתוך המיקרו-מיקסר. לאחר מכן, הפעל את המיקרו-מיקסר. אפשר לתגובה להימשך במשך 60 דקות; עם הסתיים הזמן, כבה את המיקרו-מיקסר והעבר את התגובות לקרח לשימוש מיידי ביישומים המשכיים. בהשוואה לשיטות אחרות, היתרון העיקרי של ערבוב במיקרו-מיקסר בהקשר של תגובות RT הוא תבואת ה-CD NA.
בניתוח זה של תגובת שרשרת פולימראז כמותית, עקומות ה-QPCR המשתמשות בפריימרים שנועדו לזהות cDNA המייצג mRNA של neuro one ממחישות את ההשפעות של ערבוב באמצעות microm במהלך חמש הדקות הראשונות או לאורך כל 60 הדקות, בהשוואה למשך תגובת ה-RT מיד לפני דגירת ה-RT. ערבוב באמצעות microm בחמש הדקות הראשונות לא הוביל לשיפור משמעותי. עם זאת, ערבוב באמצעות microm לאורך כל 60 הדקות הניב שיפור משמעותי בתפוקה השקול ל-15 מחזורי QPCR.
בנוסף, ניתוח עקומת המסחה של QPCR מדגים כי ערבוב מיקרו (micro mixing) לאורך כל 60 הדקות של תגובת ה-R two הקודמת מייצר אות עקבי בדגימות כפולות, כפי שמוצג בקוים האדומים. זאת בניגוד לקווים המשתנים שנצפו בעת ערבוב מיקרו בחמש הדקות הראשונות, כפי שמוצג בכחול, או בעת ערבוב בלבד, כפי שמוצג בקוים השחורים; הקווים האפורים הם בקרות ללא תבנית (no template controls).
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה חדשנית להגברת תנובת ה-cDNA מ-mRNA של תא בודד באמצעות מיקרו-מערבל (micromixer). הטכניקה מנצלת זרימה מיקרוסקופית אקוסטית (acoustic microstreaming) לשיפור ערבוב הנוזלים בתגובות שעתוק הפוך סטנדרטיות.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום מדעי
- מדעי מוח
- ביוטכנולוגיה
- גנומיקה
רקע
- סינתזת cDNA היא קריטית לניתוח ביטוי גנים.
- ניתוח של תא בודד מציב אתגרים בנוגע לתנובה של RNA.
- שיטות ערבוב מסורתיות עשויות להיות בלתי מספיקות עבור נפחים קטנים.
- מיקרו-סטריימינג אקוסטי (Acoustic microstreaming) מציע פתרון פוטנציאלי לשיפור הערבוב.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה להגברת תבחית ה-cDNA מ-mRNA של תא בודד.
- שימוש במיקרו-מיקסר (micromixer) לשיפור ערבוב הנוזלים.
- הערכת היעילות של שיטה זו בתגובות RT סטנדרטיות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- השגת שיווי משקל של המיקרו-מיקסר (micromixer) באינקובטור בטמפרטורה של 37°C.
- הכנת תגובות שעתוק הפוך (reverse transcription) סטנדרטיות עם RNA מתאיים בודדים.
- מיקום מבחנות התגובה בתוך המיקרו-מיקסר.
- התאמת פרמטרי הערבוב והפעלת המיקרו-מיקסר.
תוצאות עיקריות
- נצפו תנובות cDNA מוגברות בהשוואה לשיטות מסורתיות.
- המיקרו-מערבל (micromixer) שיפר ביעילות את הערבוב בסדרי גודל של מיקרוליטרים.
- תוצאות qPCR אישרו את התנובות המשופרות.
- השיטה ישימה עבור ניתוחי RNA שונים של תאים בודדים.
מסקנות
- המיקרו-מיקסר (micromixer) מספק יתרון משמעותי בסנתזה של cDNA מ-mRNA של תא בודד.
- גישה זו עשויה להקל על ביצוע מחקרים מדויקים יותר של ביטוי גנים.
- יישומים עתידיים עשויים לכלול אנליזות טרנסקריפטומיות נרחבות יותר של תאים בודדים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הגברת תנובת ה-cDNA מ-mRNA של תא בודד פותרת צוואר בקבוק קריטי בתהליכי תיקוף מטרות וסריקה פנוטיפית. על ידי מתן אפשרות לניתוח של מספר רב יותר של גנים לכל תא בדיוק כמותי, שיטה זו משפרת את הביטחון החזוי בהחלטות שלבים מוקדמים בגילוי. הגישה תומכת בהפחתת סיכונים של היפותזות טיפוליות באמצעות קריאות מולקולריות הניתנות לשחזור ובקנה מידה רחב, המופקות מדגימות ביולוגיות מוגבלות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בדיקת היפותזות טיפוליות על ידי הגדלת מספר מטרות הגנים הניתנות לזיהוי לתא בודד.
- ערך תפעולי: מפחית שונות טכנית בהמרה של mRNA ל-cDNA, ובכך משפר את עקביות הבדיקה בין חזרות.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי פיתוח באמצעות זיהוי מהימן יותר של תמלילי mRNA בריכוז נמוך הקשורים למנגנוני מחלה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: הכנה של ספריות cDNA עובדות עבור סריקות המשך, דבר המגביר את הרגישות לזיהוי פגיעות (hits).
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של עיבוד קלט ה-RNA באמצעות ציוד מעבדה נגיש, מה שמשפר את התפוקה.
- ערך פלטפורמה: תאימות עם ריאגנטים סטנדרטיים ל-RT ואנליטיקות של qPCR, מה שמקל על השילוב במערכי סריקה קיימים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מאפשר גילוי של סמנים ביולוגיים (biomarkers) מאוכלוסיות תאים נדירות על ידי שיפור מגבלות הגילוי עבור מטרות בעלות ביטוי נמוך או חולף.
- ערך תפעולי: מספק תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור, התומכות בסנכרון בין-תפקודי בין צוותי הגילוי לצוותים הפרה-קליניים.
- הפחתת סיכונים: מפחית סיכונים לתוצאות שגויות שליליות (false-negative) בתיקוף מטרות, על ידי הגדלת תנובת ה-cDNA ללא צורך בתשתית מיקרופלואידיקה ייעודית.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי המוקדם, ובאופן ספציפי תומכת במעבר מיצירת היפותזת המטרה לזיהוי מוביל (lead identification), על ידי שיפור האיכות והכמות של הקלטים המולקולריים לסריקה תפקודית.
- ביולוגיית גילוי: משפרת את תיקוף המטרה על ידי אפשור פרופיל תעתוק מקיף מכמויות של mRNA מתא בודד.
- סריקה: משפרת את המוכנות של הבדיקה באמצעות הגדלת תנובת ה-cDNA, ובכך תומכת בזיהוי אמין של שינויים בביטוי המושרים על ידי תרכובות.
- אנליזה: מייצרת פלטים כמותיים התואמים ל-qPCR, המאפשרים השוואה סטטיסטית של ביטוי גנים בין תנאים ניסיוניים שונים.
- מחקר תרגומי: תומכת ברציפות לעבודה פרה-קלינית על ידי אפשור זיהוי של תעתוקים רלוונטיים למחלה בדגימות מוגבלות של תאים ראשוניים.
- שימוש חוזר ארגוני: מהווה יכולת ניתנת להרחבה ובעלות נמוכה, שניתן ליישם בפרויקטים ובמערכות מודל מרובות ללא צורך בפלטפורמות מיקרופלואידיות ייעודיות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בתיקוף מטרות על ידי הפחתת רעש טכני בסנתזת cDNA מכמויות RNA מוגבלות.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) של תהליכי עבודה לבדיקת ביטוי גנים בתא בודד באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטי.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות בנוגע להמשך התהליך (go/no-go) על ידי מתן אפשרות לאפיון מולקולרי מקיף יותר לכל דגימה, ובכך מפחית תוצאות שליליות שגויות ברמה הביולוגית.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בקידום מותאם סיכונים על ידי הגברת הביטחון בנתוני מעורבות המטרה (target engagement) ומודולציית מסלולים הנגזרים מניתוחים של תאים בודדים.
שיקולי יישום
- דורש היכרות עם עקרונות המיקרו-זרם האקוסטי (acoustic microstreaming) ואופטימיזציה של פרמטרי תדר/אמפליטודה עבור נפחי תגובה ספציפיים.
- תלוי בגישה לאינקובטור עם בקרת טמפרטורה ובמבחנות PCR דקות-דופן תואמות ליצירת מניסקוס יעילה.
- מחייב סטנדרטיזציה של משך הערבוב והגדרות ההספק בין המשתמשים השונים כדי להבטיח תנובאי cDNA הניתנים לשחזור.
- כולל תיקוף של שלמות החומצות הגרעיניות לאחר הערבוב כדי לאשר היעדר דגרדציה כתוצאה מהשפעות מכניות או תרמיות.
- מוגבל ליישומים שבהם הגדלת תנובת ה-cDNA משפרת באופן ישיר את הרגישות האנליטית בשלבים הבאים, כגון qPCR או הכנת ספריות לרצף.
