יצירת חולף קרום התא הנקבוביות באמצעות מדפסת הזרקת דיו רגילה

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא ליצור נקבים זמניים בממברנות של תאים באמצעות הדפסת הזרקת דיו. דבר זה מושג תחילה על ידי התאמה של מדפסת הזרקת דיו סטנדרטית. השלב השני הוא ריקון וניקוי של מחסנית דיו סטנדרטית של המדפסת כדי לאפשר את הכנסת הביו-דיו.

בשלב הבא, התאים המבוקשים מושעים בתמיסה של מונומרי אקטין המסומנים פלורוצנטית וב-PBS כדי ליצור את תמיסת הדיו הביולוגי. השלב הסופי הוא הדפסת הדיו הביולוגי על גשמיות מיקרוסקופ באמצעות המדפסת והמחסנית המותאמות. לבסוף, ניתן להשתמש במיקרוסקופיה פלורוצנטית כדי להראות כי מונומרי G actin המצומדים ל-Fluor four הופנמו לתוך התאים המודפסים דרך נקבי ממברנה זמניים.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני טכניקות סטנדרטיות של טרנספקציה והזרקה מיקרוסקופית לתאים הוא שטכניקת הדפסה זו קלה לשימוש ומניבה חיות תאים גבוהה. למרות שטכניקה זו יכולה לספק תובנות בתחום הגנטיקה, ניתן ליישמה גם בתחומי מחקר אחרים, כגון ביופיזיקה של התא והנדסת רקמות בביופיזיקה של התא. ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לצפות בקלות בשלד התא במהלך נדידת תאים.

הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר רצינו להיות מסוגלים להדמיא ויזואלית שינויים בסידור השלד התאי כתוצאה מכוחות המופעלים על תאים. התחילו בשחרור התפסים מפלסטיק מהבסיס התחתון של המדפסת ולאחר מכן הרימו באיטיות את כיסוי הפלסטיק העליון. לאחר מכן, נתקו את פאנל תאורת תצוגת הכפתורים מהחלק העליון של המדפסת, תוך השארתו מחובר ללוח האם של המדפסת.

באמצעות מגבוני Kim ואתנול, נקה את החלק הפנימי של המדפסת, ובמיוחד את האזורים שבהם נח cartridge הדיו ואת אזור ההדפסה. לאחר מכן, אתר את הכבל המספק חשמל למנגנוני הזנת הנייר של ה-HP desk Jet 500.

הם נמצאים ממש מתחת למגש הנייר משמאל לחלק הקדמי; נתקו את הכבלים מלוח האם. כעת אתרו את מנגנון זיהוי הנייר וחברו לולאת חוט למנוף הפלסטיק האפור שנמצא מעל ומאחורי מנגנון הזנת נייר ההדפסה כדי שישמש כידית ידנית, והניחו כאן במה. מחזיק הספוג למשלוח של 15 מבחנות צנטריפוגה משמש יחד עם מספר זכוכיות מיקרוסקופ המודבקות במקומן באזור ההדפסה שלפני מנגנון הזנת הנייר, וזאת כדי להביא את זכוכיות ההדפסה הרצויות למפלס הנמצא ממש מתחת לראש ההדפסה של המחסנית.

לבסוף, כדי לשמור על טכניקה אספטית, מקמו את המדפסת בתוך מbigcup זרימה למינרית. התחילו בהוצאת המחסנית מאריזתה, כאשר הסרט המגן המכסה את מגעי המדפסת ואת ראש ההדפסה נשאר במקומו. ייצבו את גוף המחסנית באמצעות תפס, כך שהחלק העליון הירוק יישאר נקי ממכשולים, והשתמשו בכלי חיתוך סיבובי ידני.

חיתכו את החלק העליון הירוק של המחסנית, רוקנו את הדיו שנותר מהמאגר, ולאחר מכן הסירו את סרט ההגנה מפלסטיק המכסה את מגעי המדפסת ואת ראש ההדפסה. המים עשויים לדלוף מראש ההדפסה במהלך תהליך זה, אך הדבר לא יגרום נזק למחסנית. כאשר המים שיוצאים יהיו צלולים, הניחו למחסנית להתייבש.

כדי לשמור על סביבת הדפסה נקייה, התחילו בהטבלה מלאה של המחסנית בבכור מלא במים דה-יוניזציה, ולאחר מכן בצעו סוניקציה למחסנית למשך 15 דקות. לאחר הסוניקציה, הוציאו את המחסנית ונקעו ממנה את עודפי המים. רססו ethanol 70% לתוך המחסנית כדי ליצור סביבה אספטית יותר.

לאחר קצירת התאים הרצויים, סבב את התאים בחמישה מיליליטר של מצע טרי בתוך מבחנה קונית של 15 מיליליטר למשך חמש דקות ב-250 ×g בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, שאב את המצע ותלה את התאים בריכוז של 1 × 10⁵ תאים למיליליטר בתמיסת סטוק של fluorescent G actin שהוכנה טרי. ליצירת דיו ביולוגי, שימו לב ש-250 µL של דיו ביולוגי מדפיס שלוש לוחות כיסוי עם דפוס הקווים המוצג כאן. לאחר הדלקת המדפסת וחימומה, מקמו כאן את משטח ההדפסה הרצוי; לוחות כיסוי של 22 מילימטר על 22 מילימטר מונחים במרכז הבמה שהורכבה קודם לכן.

בשלב הבא, פתחו תוכנה לשרטוט ובחרו את התבנית הרצויה. כעת, העבירו בפיפט כ-100 עד 120 µL מתלי השהייה של התאים אל הבאר המעגלית הקטנה בתחתית תא המחסנית. הדפיסו את הקובץ; בזמן שהמדפסת מתחממת שוב, המחסנית תעבור למצב מוכן.

כאשר המחסנית נעה מעט שמאלה מבאר טפטוף הדיו ונשארת שם, משוך למעלה את מנגנון הזנת הנייר והחוט, וההדפסה תחל. המדפסת תדפיס על זכוכית כיסוי המונחת במרכז במת ההדפסה באמצעות מדפסת HP desk jet 500 עם דיו ביולוגי המורכב מתמיסת תאי פיברובלסט בתוך תמיסת G actin monomer.

בתוך סדרה של HP 26, הודפסו תאי מחסנית דיו על לבישי זכוכית של מיקרוסקופ. איור זה ממחיש תוצאה מייצגת של תאי פיברובלסט מודפסים המראים מונומרים פלואורסצנטיים של אקטין ששולבו בהם. תבנית זו שימשה באיור הקודם ליצירת קו רציף של תמיסת ההדפסה לאורך רוב לביד המיקרוסקופ.

באיור זה מוצג הקו הישר שבו הופקדו באופן הדדי ה-biolink והתאים. שימו לב כי מיד לאחר ההדפסה קיימת עלייה בفلורסצנציית הרקע, מכיוון שתמיסת ה-biolink שבה התאים מושעים מכילה עודף של מונומרים פלואורסצנטיים חופשיים של actin; דגירה של התאים למשך כ-10 דקות לאחר ההדפסה מקלה על ההיצמדות לסלייד, ומאפשרת לשטוף את תמיסת העודף של המונומרים מהמצע באמצעות מצע גידול טרי, מה שמפחית משמעותית את פלורסצנציית הרקע. כאן מוצגת תמונה מייצגת של שלושה תאי fibroblast מסוג T3 שהודפסו באזור הדפסה מקומי; כפי שמוצג, מיקרוגרף זה בצילום מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של תא שצולם 15 דקות לאחר ההדפסה מראה את ה-giin בירוק, את הגרעין בכחול, ואת השכבה המשולבת (overlay) של ה-GI actin ושל הצבע הגרעיני.

שתי התמונות הבאות מציגות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של שני פיברובלסטים בתבנית קווית שלוש שעות לאחר ההדפסה. תמונה ראשונה זו מראה מונומרים של actin המסומנים פלואורסצנטית בתוך התאים. תמונה שנייה זו היא סמיכה של הערוץ הפלואורסצנטי על תמונת הרקע, כדי להראות שלמרות שייתכנו שאריות על הפסלית בפינה השמאלית התחתונה, הן אינן פלואורסצנטיות.

לבסוף, מוצגת כאן קבוצת ביקורת של תאים שלא הודפסו, אשר דגרו במשך שלוש שעות עם מונומרים המסומנים פלואורסצנטית, כדי להדגים כי מונומרים אינם יכולים לחדור דרך ממבט התא ללא חדירות ממברנה המושגת על ידי הדפסת תאים. בעת ביצוע הליך זה, חשוב להכין מספר מחסניות נקיות ומוכנות לשימוש, שכן סתימה של המדפסת היא אחת הבעיות המעכבות טכניקה זו. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי אופן המרת מדפסת שולחנית סטנדרטית להדפסת תאים חיים, דבר המסייע ביצירת כוח ממברנה זמני.