Multiparametric מיפוי אופטי של הלב Langendorff-perfused הארנב
13 בספטמבר 2011
מאמר זה מתאר את ההליכים הבסיסיים לעריכת ניסויים מיפוי אופטי בלב Langendorff-perfused הארנב באמצעות מערכת הדמיה פנורמית, ואת שיטת כפול (מתח סידן) הדמיה.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לחקור תכונות אלקטרופיזיולוגיות של הלב, כגון הולכה, רפולריזציה, אריתמוגנזה וניהול סידן, באמצעות טכניקות של מיפוי אופטי בלב ארנב בפרפוזיה בשיטת langor. מטרה זו מושגת תחילה על ידי בידוד וביצוע פרפוזיה רטרוגרדית של לב ארנב שלם דרך האאורטה. השלב הבא של הפרוצדורה הוא חשיפת פני השטח של הלב, השבתה של התכווצויות הלב באמצעות חסמי ערוצי סידן (excitation contraction on Coler BLEs statin), וצביעה נכונה של המיוקרדיום באמצעות אינדיקטורים פלואורסצנטיים רגישים למתח ולסידן.
לאחר מכן, מבוצעות הקלטות של פוטנציאלי פעולה אופטיים ממרבית האפיקרדיום של הפרונטריקולר באמצעות מערכת מיפוי אופטית פנורמית. אותות אופטיים ממופים לאחר מכן על גיאומטריית תלת-ממד ששוחזרה של פני השטח של האפיקרדיום של הלב. במהלך שלב זה, ניתן להקליט בו-זמנית את פוטנציאל הפעולה האופטי ואת הטרנזיינט של הסידן באמצעות מערכת דימוי כפולה שאינה פנורמית.
נוהל זה מספק נתונים כמותיים של השריר הלבבי במרחב ובזמן, של העירור והרפולריזציה, וכן מאפיינים תואמים של ויסות הסידן, אותם ניתן לנתח במהלך קצב רגיל וכן במצבים של אריתמיה בעלייה ובחדר. שלום, שמי ד"ר Iger Eov. אני פרופסור להנדסה ביו-רפואית באוניברסיטת Washington ב-St.Louis.
הטכניקה האופטית שאנו מציגים היום היא טכנולוגיה ייחודית בעלת מספר יתרונות על פני מיקרו-אלקטרוגרמות מסורתיות, שכן היא מסוגלת להקליט עשרות ואלפי פוטנציאלי פעולה ותופעות לוואי של סידן (calcium transients) בו-זמנית. יתרה מכך, טכנולוגיה זו חסינה מפני ארטיפקטים הנובעים מגירוי חשמלי ומדפיברילציה, אשר מעוותים באופן משמעותי פוטנציאלי פעולה המוקלטים בכל אלקטרוגרמה. בנוסף, תופעות לוואי של סידן ניתנות להקלטה באמצעות טכניקה זו בלבד.
אין פשוט חלופה אחרת. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום האלקטרופיזיולוגיה של הלב, כגון מנגנוני ההשראה, התחזוקה והסיום של הפרעות קצב עליותיות ובטניות המסכנות חיים, כמו גם מידול תפקוד ההולכה, העירור והצימוד בין העירור לכיווץ במחלות כגון מחלות לב מולדות, מחלות מטבוליות ואי-ספיקת לב. לאחר ההכנה לניתוח, יש להקלי את הארנב באמצעות תערובת של sodium pentobarbital ו-heparin.
ברגע שהארנב אינו מגיב עוד לרפלקס כאב, פתח את בית החזה והוצא את הלב והריאות. בצע חתך בקצה העליון של האביון העולה (ascending aorta), לפני כל ענפי קשת האביון, והפעל את המשאבה כדי להתחיל את זרימת תמיסת ה-Tyro במערכת הפרפוזיית LRF ללא סירקולציה. חבר במהירות את הלב לקנולת אביון במידה 16 המחוברת למערכת הפרפוזיית LOR.
רוקנו את האוויר מהאאורטה וקשרו את קנולת האאורטה לאחר ביצוע פרפוזיה מלאה. פתחו מיד את פרוקרדיום. לאחר מכן, הסירו את רקמת השומן של הריאות והטרכאה המקיפה את הלב ואת רקמות החיבור.
חשוב מאוד למנוע הצטברות של נוזלים בחדר השמאלי, דבר שעלול לגרום לאיסכמיה. לכן, הכניסו צינור ניקוז מסליקון דרך וריד ריאתי ודרך המסתם המיטרלי אל תוך החדר השמאלי. כעת, העבירו את הלב עם הקנולה למערכת הפרפוזיה Langendorff עם סירקולציה, המצוידת במערכת מיפוי אופטי.
הניחו את הלב בתא משושה בהתאמה אישית וחברו את הקנולה למערכת הפרפוזיה. נטרו את הלחץ האורטלי באמצעות מתמר לחץ ושמרו עליו ברמה של כ-60 פלוס או מינוס 5 millimeters of mercury על ידי כיוונון קצב הזרימה של משאבת הפרפוזיה. שמרו על ה-pH סביב 7.35 פלוס או מינוס 0.05.
כבו את תאורת החדר והזריקו לאט את תמיסת המלאי של ה-BLEs statin הרגישה לאור דרך פתח ההזרקה במלכודת בועות האוויר הממוקמת מעל לקנולה. כדי להגיע לריכוז של 10 micromolar של BLEs statin, הזריקו לאט 0.1 milliliters של BLEs statin. לאחר כל הזרקת בולוס, המתינו להתייצבות הלחץ לפני ההזרקה הבאה.
מקמו את מערכי הפוטודיודות או ה-PDAs בשלוש זוויות במרווחים שווים סביב הלב. לאחר מכן, בכל PDA, התאימו את מיקוד תמונת הלב על הזכוכית החלבית של מישור התמונה. כווננו את מיקום הקנולה בתא המשושה ואת כל PDA עד שהלב ייכנס לשדה הראייה של שלושת ה-PDAs.
לאחר מכן, צלם כל תמונה ממוקדת על הזכוכית המט. הזרק באיטיות 10 עד 20 µL של תמיסת מלאי D four Anep לתוך תמיסת הפרפוזיה דרך פתח ההזרקה במלכודת בועות האוויר. המתן שלוש דקות.
בשלב הבא, הניחו בעדינות את אלקטרודת הקוצב במיקום הרצוי. במקרה זה, היא מונחת במרכז המבט הקדמי של הלב. התחילו בביצוע הקלטה אופטית סימולטנית מה-PDAs.
וודאו שאין ארטיפקטים של תנועה באות האופטי ושיחס הסיגנל לרעש מספיק לצורך ניתוח נתונים עוקב. עם הסיום, הדליקו את אורות החדר ובצעו תיעוד צילומי של הלב על ידי צילום תמונה אחת עבור כל 10 מעלות של סיבוב ממצלמה הממוקמת במיקום של אחד ה-PDAs. לאחר מכן, עברו לניקוי מערכת הפרפוזיה.
הנח את הלב הקנונלי בתא זכוכית מתאים וחבר את הקנולה למערכת הפרפוזיה. קבע את הלב לתחתית הסיליקון של התא בנקודת השיא של החדרים ובפרוזדורים. כדי לקבע את הלב, כבה את תאורת החדר והזרק לאט BLEs statin דרך פתח ההזרקה כדי להפחית את תנועת פני השטח של התמיסה.
הנח כיסוי זכוכית מעל פני השטח של האפיקרד. חלק זה של הפרוצדורה מבוצע בדרך כלל בחושך, אך כאן הוא מבוצע באור. כדי לשפר את איכות תמונת הווידאו, העבר את מערכת ההדמיה הכפולה מעל הלב.
כעת התמקדו בשתי מצלמות ה-CMO באותו שדה ראייה. לאחר מכן, מקמו את מוליכי האור עבור שתי נורות הלוגן עם מסנן עירור. צבעו את הלב על ידי הוספת 10 עד 20 µL של הצבע הרגיש למתח RH 2 37 דרך פתח ההזרקה.
לאחר מכן, הוסף 200 µL של road 2:00 AM עם onic F1 27 בתערובת של יחס אחד לאחד דרך פתח מלכודות הבועות. המתן כ-20 דקות כדי לאפשר את ה-DS ification של ה-road 2:00 AM לפני תחילת המיפוי. כעת בצע הקלטת בדיקה.
כבה את משאבת הסופר-פוזיה כדי למנוע תנועה על פני השטח של התמיסה. הדלק את נורות ההלוגן ובצע הקלטה אופטית משתי המצלמות. לאחר מכן, כבה את אור העירור.
הפעל את משאבת הסופרפוזיה ובדוק את איכות האותות האופטיים. אם האות חלש, צבע מחדש את הלב עם RH 2 37 נוסף ו road 2:00 AM. אם קיימים ארטיפקטים של תנועה, הוסף BLEs statin נוסף כדי להסיר את התנועה. לאחר שכל הדברים תקינים, המשך בניסוי המתוכנן ונקה את המערכת.
עם סיום התהליך, נעשה שימוש במערכת המיפוי האופטי הפנורמית כדי להציג מבט קדמי זה של לב ארנב שעבר פרפוזיה בשיטת Lang Endorf. לשם השוואה, שחזור של גאומטריית הלב מציג את אותו מבט קדמי. פני השטח של האפיקרד שניתן להם "פריסה" (unwrapped) המוצגים כאן מקודדים בצבעים לפי פאזה.
הלב עבר אירוע של tachy-arrhythmia מחמישה מיקומים סביב הרוטור. הוצגו פוטנציאלי פעולה אופטיים. כאן, באדום, נראה חזית הפעלה המתפשטת במהלך מחזור של reran arrhythmia יציב.
חזית הגל מסתובבת עם כיוון השעון סביב סינגולריות פאזה במשטח הקדמי של הלב. הדפולריזציה מוצגת בכחול שקוף כדי לאפשר ויזואליזציה של חזיתות הגל במשטח האחורי. הלב נבדק באמצעות מערכת מיפוי כפולה כדי להראות מיפוי סימולטני של פוטנציאלי פעולה וטרנזיינטים של סידן.
תמונה א' במבט מקרוב של הקלטות מאתר אחד מראה שפוטנציאלי פעולה מסומנים בכחול ותנודות סידן מסומנות באדום. מוצג מערך של עקבות לדוגמה ממערך של אתרים במרווחים שווים, כפי שמוצג על ידי הנקודות במבט קדמי זה. נתונים אלו נאספו ברזולוציה אופטית של 200 microns על 200 microns לפיקסל.
ההשלכות של הטיפול מרחיבות את טיפול הדפיברילציה עבור הפרעות קצב עליותיות ובטניות, מכיוון שאנו יכולים להדמיאן באופן ישיר את ההשפעה של גירויים חשמליים חזקים במהלך האלקטרו-תרפיה. שום שיטה חלופית אינה מסוגלת לעשות זאת. באמצעות שיטה זו, פיתחנו ותיקפנו טיפול דפילציה חדש, נטול כאב ובמתח נמוך, עבור פרפור פרוזדורים וטכיקרדיה בטנית.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר את הפרוצדורות לביצוע ניסויי מיפוי אופטי בלב ארנב בפרפוזיה בשיטת Langendorff תוך שימוש במערכת דימוי פנורמית. המחקר מתמקד בתכונות אלקטרופיזיולוגיות של הלב, כולל הולכה וטיפול בסידן.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אלקטרופיזיולוגיה של הלב
- טכניקות של מיפוי אופטי
- אריתמוגנזה
רקע
- מיפוי אופטי מאפשר הקלטה סימולטנית של פוטנציאלי פעולה ושינויים בריכוז הסידן.
- שיטה זו מספקת תובנות לגבי תפקוד הלב והפרעות קצב.
- שיטות מסורתיות עשויות להיות מוגבלות בשל ארטיפקטים הנובעים מגירוי חשמלי.
- המחקר משתמש במודל של לב ארנב בבישול מסוג Langendorff.
מטרת המחקר
- לחקר ההולכה הלבבית, הרפולריזציה והאריתמוגנזה.
- לניתוח ניהול הסידן בשריר הלב (myocardium).
- לספק נתונים כמותיים על דינמיקת העירור והרפולריזציה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד ופרפוזיה רטרוגרדית של לב ארנבת.
- צביעה של המיוקרדיום באמצעות אינדיקטורים פלואורסצנטיים רגישים למתח וلسידן.
- הקלטה של פוטנציאלי פעולה אופטיים באמצעות מערכת מיפוי אופטית פנורמית.
- דימוי כפול סימולטני של פוטנציאלי פעולה אופטיים וטרנזיינטים של סידן.
תוצאות עיקריות
- נתונים כמותיים על מאפיינים מרחביים וזמניים של השריר הלבבי (myocardium).
- תובנות לגבי המנגנונים של הפרעות קצב ומחלות לב.
- הדגמה של היתרונות של מיפוי אופטי על פני אלקטרוגרמות מסורתיות.
מסקנות
- מיפוי אופטי הוא כלי רב עוצמה לחקר האלקטרופיזיולוגיה של הלב.
- טכניקה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח במחקר על הפרעות קצב הלב.
- מחקרים עתידיים יכולים להשתמש בשיטה זו כדי להגיע לתובנות עמוקות יותר לגבי תפקוד הלב.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מיפוי אופטי בלבבות ארנב בבישול (פרפוזיה) בשיטת לנגדורף (Langendorff) מאפשר ויזואליזציה ברזולוציה גבוהה וללא ארטיפקטים של אלקטרופיזיולוגיה לבבית, ובכך תומך בהסרת סיכונים מכנית (de-risking) בתהליך תיקוף של מטרות לטיפול באריתמיות. גישה זו מספקת נתונים מרחביים-זמניים כמותיים על פוטנציאלי פעולה ותופעות חולפות של סידן, המעניקים בסיס ישיר לביטחון ניבוי במודלים פרה-קליניים של אריתמיות חדרים ועליות. השיטה מגשרת בין ביולוגיה של גילוי למחקר טרנסלציונלי, על ידי אפשור הערכה הדירה וניתנת להרחבה של פוטנציאל פרו-אריתמי ותגובה טיפולית במערכת הרלוונטית למחלה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: בוחן היפותזות טיפוליות באמצעות מיפוי של דינמיקת גלי רה-אנטרי (reentrant wave) וסינגולריות פאזה במהלך הפרעות קצב מושריות.
- ערך תפעולי: מאפשר תיקוף של מטרות פונקציונליות באמצעות דימות סימולטני של מתח וסידן להפחתת סיכונים במנגנוני צימוד עירור-התכווצות.
- ערך ניבוי: תומך במיון תיקי מוצרים באמצעות כימות של פגיעות הסובסטרט האריתמוגני תחת תנאי פרפוזיה מבוקרים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: הכנת מערכות ביולוגיות מתוקפות עבור תהליכי עבודה המשכיים, באמצעות קביעת פנוטיפים בסיסיים של תפקוד אלקטרופיזיולוגי וטיפול בסידן.
- ערך תפעולי: טיפול בסטנדרטיזציה של הבדיקה ובשחזוריות באמצעות בקרת פרפוזיה של Langendorff ופרוטוקולי צביעה בצבעים.
- סקביליות: הדגשת המוכנות לסריקה באמצעות מערכות דימוי פנורמיות וכפולות המסוגלות להקלטה אופטית בו-זמנית ממספר אתרים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- רלוונטיות למחלה: שימוש במודל לב של ארנבת שהוכחה דמיון להצמדת עירור-התכווצות (excitation-contraction coupling) ולדפוסי גלי אריתמיה בבני אדם.
- המשכיות תרגומית: מקשר בין ממצאי גילוי לוולידציה פרה-קלינית באמצעות ניתוח כמותי של הולכה, רפולריזציה וטיפול בסידן במהלך קצב רגיל ואריתמיה.
- קידום מותאם סיכון: תומך בהחלטות go/no-go על ידי אספקת תובנות מכניסטיות לגבי השראת אריתמיה, תחלוقتها וסיומה.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף מטרה דרך זיהוי מוביל ועד להערכה פרה-קלינית, ומאפשרת שיפור איטרטיבי של מועמדים לאנטי-אריתמיים על בסיס פרופילים של תפקוד אלקטרופיזיולוגי וטיפול בסידן.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי ויזואליזציה של דינמיקת רוטורים וקשרי פוטנציאל פעולה עם תנודות סידן במהלך arrhythmogenesis.
- סריקה: מתאר את המוכנות של הבדיקה באמצעות רכישת אות אופטי ניתנת לשחזור עם יחס אות-רעש מספיק לניתוח מרחבי-זמני.
- אנליטיקה: מדגיש מדידות כמותיות של דינמיקת עירור ורפולריזציה, המאפשרות הערכה השוואתית של תנאים.
- מחקר תרגומי: מקשר את השיטה לרציפות פרה-קלינית באמצעות מודלים של הפרעות קצב רלוונטיים למחלה ותובנות על ויסות סידן הרלוונטיות לאי-ספיקת לב ומחלות מטבוליות.
- שימוש חוזר ארגוני: מציג את מערכת המיפוי האופטי כפלטפורמה לשימוש חוזר להערכת תרכובות מרובות או מוטציות גנטיות בהכנה סטנדרטית של לב מבושף.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חזוי בתיקוף המטרה, הפחתת עמימות מנגנונית במנגנוני הפרעות קצב לב.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת הרחבה של מדידות אלקטרופיזיולוגיות ומדידות תנודות סידן.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות משופרת לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go), יעילות הון והפחתת סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בתוכניות לב-כלי דם.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעודוף והחלטות קידום מותאמות לסיכון, המבוססות על נתונים כמותיים של פוטנציאל להפרעות קצב.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בבידוד לב, פרפוזיה בשיטת Langendorff וטיפול בצבעים פלואורסצנטיים.
- נדרשות מערכות מיפוי אופטי עם מערכי פוטודיודות או מצלמות CMOS, מקורות אור ובקרת לחץ פרפוזיה.
- דורש סטנדרטיזציה בין צוותים של פרוטוקולי צביעה, ניתוק של התהליך המכיווץ (excitation-contraction uncoupling) ופרמטרי רכישת אותות.
- כולל שיקולי התאמה לקצבי זרימה, אופטיקה והטענת צבע ספציפיים למינים בעת הרחבה מעבר ללבות של ארנב.
- כולל מגבלות מעשיות כגון דהייה פוטוכימית של הצבע (photobleaching), רגישות לארטיפקטים של תנועה והצורך בתחזוקה מדויקת של הטמפרטורה וה-pH במהלך הניסויים.
