תא בודד הגורל מיפוי של דג הזברה

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבצע מיפוי גורל ומעקב שושלת של תאים בודדים נבחרים בעוברים של דגי זברה. דבר זה מושג על ידי צימוד כימי של פלואורסצאין כלוב (caged fluorescein) לדקסטראן בעל משקל מולקולרי גבוה. לאחר מכן, הפלואורסצאין דקסטראן הכלוב שהוכן מוזרק במיקרו-הזרקה לעוברים של דגי זברה, ולאחר מכן מופעל פוטו-כימית בתאים נבחרים באמצעות ספיגה של שני פוטונים.

לאחר הפעלה פוטואופטית של העוברים, מבוצע ניתוח אימונוהיסטוכימי לגילוי הפלואורסצאין-דקסטראן ששוחרר מהכלוב (uncaged) כדי למפות את גורל התאים שהופעלו. בסופו של דבר, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לקבוע את תרומת השושלת ואת המיקום הרקמתי של תאים בודדים שהופעלו פוטואופטית. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מיקרוסקופיה פלואורסצנטית סטנדרטית, הוא שניתן להשתמש בה כדי לסמן באופן דיפרנציאלי תאים בודדים לצורך מיפוי גורל.

שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בביולוגיה התפתחותית, כגון האופן שבו תאי מקור לא מובחנים יכולים לתרום לסוגים שונים של רקמות. הדגמה ויזואלית היא קריטית, מאחר ששלבי קיבוע העובר והפוטו-אקטיבציה קשים ללמידה על בסיס תיאור טקסטואלי בלבד. לפני התחלת העבודה, סנתזו caged fluorescein dextran ואחסנו אותו במבחנות מכוסות בנייר אלומיניום. לאחר מכן, בצעו מיקרו-הזרקה לעוברי שלב תא אחד עד שניים של ה-caged fluorescein dextran שסונתז.

לאחר שהעוברים הגיעו לשלב הפיתוח המתאים, יש לצפות אותם. לאחר מכן, יש להטמיע את העוברים המצופים באגרוז בעל נקודת התכה נמוכה לצורך הפעלה פוטואקומיסטית. כאשר האגרוז התמצב, יש לטעון את תוכנת ה-LSM 510.

הנח מסנן צהוב שקוף במסלול קרן האור הלבן, לאחר מכן בחר בסריקת תמונה חדשה (scan new image) ולחץ על מצב מומחה (start expert mode). בחר בלשונית הלייזר (laser), והפעל את מקורות הלייזר argon ion ו-mi tai. הגדר את אורך הגל של ה-mi tai ל-740 nm.

בשלב הבא, בחרו בלשונית ה-config. הגדירו את תצורות הנתיב האופטי עבור ה-argonne ion וה-mi tai laser. לאחר מכן, בחרו בלשונית ה-scan.

שנו את העדשה לאובייקטיב של 20x0.8. הגדירו את מהירות הסריקה המקסימלית על ידי לחיצה על max set mode method והגדרת המספרים ל-line ו-mean בהתאמה תחת לשונית channels; בטלו את הבחירה בכל מקורות הלייזר למעט ה-mi tai. לאחר מכן, מקמו מד הספק (power meter) במסלול הקרן האופטית, ובחרו בכפתור con כדי להפעיל סריקה רציפה.

כווננו את אחוז ההעברה עד שמד ההספק יראה הספק לייזר ממוצע של 47 milliwatts. לאחר מכן, הפסיקו את הסריקה על ידי לחיצה על כפתור העצירה תחת הלשונית channels. בטלו את הבחירה במקור הלייזר mi tai ובחרו ב-argonne iron.

לאחר מכן, בחרו שוב בכפתור fast XY תחת לשונית הערוצים (channels), וכווננו את הפינהול (pinhole). כווננו את ה-Detect gain, את ה-amplify a offset ואת ה-amplify שוב עבור לייזר הארגון (Argonne iron laser) כדי להשיג את איכות התמונה הטובה ביותר. באמצעות בקר הבמה, אתרו ומקדמו את התא שברצונכם להפעיל, ולאחר מכן לחצו על כפתור העצירה (stop). בעזרת כלי החיתוך (crop tool), חתכו את התא המופעל כך שגורם החיתוך (crop factor) תחת לשונית המצב (mode) יציג ערך של 50 עד 70.

לאחר מכן, הפסיקו את הסריקה על ידי לחיצה על כפתור העצירה (stop) תחת לשונית הערוצים (channels). בטלו את הבחירה בלייזר ארגון (argon laser) ובחרו בלייזר My Tai תחת לשונית המצב (mode). הגדירו את מהירות הסריקה ל-31.46 שניות.

לאחר מכן, בחרו בכפתור הבודד כדי להתחיל את הסריקה להפעלה דו-פוטונית של ה-caged fluorescein dextran בתא הנבחר. לאחר ההפעלה, עברו ללשונית הערוצים (channels), בטלו כעת את הבחירה בלייזר ה-mi tai ובחרו שוב בלייזר הארגון (argon ion laser). לאחר מכן, תחת מצב (mode), הגדירו את מקדם הזום ל-1. לשלב הבא.

תחת כותרת המהירות (speed), לחצו על כפתור ה-max כדי להגדיר את מהירות הסריקה המהירה ביותר. כדי לבחון את האזור שהופעל פוטו-כימית, בחרו ב-fast xy. לאחר מכן, בחרו בלשונית הערוצים (channels), כווןנו את ה-pinhole ובצעו גילוי (detect) פעם נוספת, ובדקו שהאזור שהופעל פוטו-כימית לא עבר אבלציה בלייזר.

לאחר הכנת העוברים המופעלים פוטו-כימית לזיהוי אימונו-פלואורסצנטי של fluorescein dextran ששוחרר מכלוב (uncaged), בהתאם לפרוטוקול המפורט בכתב היד המצורף, שטפו את העוברים שש פעמים ב-PBT ופעמיים בבופר AP. לאחר מכן, העבירו את העוברים ללוחיות בעלות תשעה בארות המכילות בופר AP.

שאיפ את בופר ה-AP והוסף N-B-T-B-C-I-P. עצור את התפתחות הצביעה של ה-N-B-T-B-C-I-P על ידי שאיפת תמיסת ה-N-B-T-B-C-I-P. לאחר מכן, שטוף את העוברים ב-PBT.

כעת הוציאו את העוברים ונערנו אותם על פלטפורמה מסתובבת למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, חזרו על השטיפה ב-PBT פעמיים נוספות. לבסוף, קבעו את העוברים ב-0.6% low melting agarose ורכשו תמונות של התאים שהופעלו פוטו-כימית באמצעות מיקרוסקופ קומפוזיט אנכי.

באיור זה מוצגת תמונת שדה בהיר (brightfield) משמאל ותמונת פלואורסצנציה מימין של עובר דג זברה שהוזרק לו במיקרו-הזרקה גדיל של fluorescein dextran כלוב לפני הפעלה פוטו-כימית. כפי שמוצג כאן, העובר הופעל פוטו-כימית באחד הסומיטים המסומן בחץ בתמונת השדה בהיר משמאל, באורך גל של 740 nanometers, זמן סריקה של 31 seconds, והספק לייזר ממוצע של 47 milliwatts. בתמונה מימין ניתן להבחין בתוצרי פלואורסצנציה של ה-fluorescein dextran ששחרר מהכלוב לאחר ההפעלה הפוטו-כימית.

צביעה אימונית של פלואורסצאין דקסטראן שאינו כלוא מוצגת באזור קטן בלוח הצדי, בבלסטוֹדֶרמה של עובר בשלב סומיט ה-10. הפוטוריבואקטיבציה בוצעה באמצעות אותם פרמטרי לייזר כפי שהוצגו באיור הקודם, תוך שימוש בפרוצדורת זיהוי אימונית. ניתן לזהות את האזור שהופעל, כפי שמסומן כאן על ידי החץ, עם צביעת רקע מינימלית לאחר ביצוע פרוצדורה זו.

ניתן לבצע ניתוחים נוספים, כגון צביעה אימונוהיסטוכימית לסמנים ספציפיים לרקמות שונות, על מנת לאפיין טוב יותר את מיקומם וגורלם של התאים המסומנים. שימוש בטכניקה זו סולל את הדרך עבור חוקרים בתחום הביולוגיה של כלי הדם לחקור את מקורם של תאי פרוגניטור עורקיים בוורידים בעוברים של דגי זברה בהתפתחות. זכרו כי בעבודה עם ריאגנטים כימיים כגון NBT ו-BCIP, אלה עלולים להיות מסוכנים ביותר ויש להשתמש תמיד בכפפות.