Explants Blastomere לבדיקת מחויבות גורל תא במהלך התפתחות עוברית

השיטה המוצגת בסרטון זה עושה שימוש במפות גורל (fate maps) של עובר opus בשלב הפילול כדי לזהות בלאסטומרים בודדים עבור תרבית בבידוד, זאת כדי להעריך האם הגורל העוברי נקבע על ידי הנחיות פנימיות או חיצוניות. ראשית, נאספים עוברים בשלב של שני תאים, שבהם חריץ הפילול הראשון חוצה את האזור בעל הפיגמנטציה הקלה של ההמיספירה הגבית (animal hemisphere). עוברים אלו מתושבחים. כאשר העוברים מגיעים ל-16 עד 32 תאים, מסירים את קרום הוויטלין (vitelline membrane) וסביב התא הנבחר מנתקים את התאים השכנים. לצורך הסבר, הבלאסטומר המנותק מועבר לאחר מכן לשקע בבאר תרבית מצופה באגרה ומתורבת.

ברגע שהאקספלאנט (explant) מגיע לשלב הרצוי, הוא נאסף כדי להעריך ביטוי של גנים או חלבונים באמצעות היברידיזציה in situ, QPCR או אימונוהיסטוכימיה. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות אחרות, כגון תרביות של קבוצות גדולות של תאי עובר או ביKיול אורגנואידים, הוא שניתן לתרבת תאי עובר בודדים, שגורלם ההתפתחותי ידוע ממחקרי מעקב שושלת (lineage tracing), ללא תוספת של גורמי גדילה או נוכחות של תאים שכנים. לפיכך, ניתן לבחון באופן ישיר האם גורמים פנימיים של התא מנחים אותו להפוך לאב-טיפוס של רקמה ספציפית, או שמא הוא זקוק לאותים מתאים סביבתיים.

הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, כיוון שה dissection של Blairs והעברתם לבארי תרבית דורשים מניפולציות עדינות תחת מיקרוסקופ סטראו. בסרטון זה, אשתמש בשיטה זו כדי להדגים האם mRNAs ממקור אימהי מטים את התאים לעבר גורל עצבי. עבודה תחת מיקרוסקופ dissection. השחיזו ארבעה סטים של פינצטות באמצעות סרט שחירה של Illumina.

זוג פינצטות אחד משמש כגיבוי למקרה שראש הפינצטה יפגע במהלך הפרוצדורה; עקרו את כל ארבעת זוגות הפינצטות ואחסנו אותם במכל סטרילי. הכינו 500 milliliters של כל אחד מהתמיסות 0.1 x ו-1.0 x של modified barth saline או MBS, והעבירו אותן סטריליזציה באמצעות סינון. אחסנו תמיסות אלו בטמפרטורה של 14 עד 18 degrees Celsius למשך חודשים בבקבוק זכוכית עם פקק הברגה. הכינו 2% agarose בדרגת electrophoresis ב-100 milliliters של מצע גידול 1 X. עקרו כדי להמיס את ה-agarose; חממו במיקרוגל כדי להנזיל את ה-agarose כאשר הוא יידרש שוב בעודו נוזלי.

שפכו כ-0.5 milliliters לתחתית של כל באר בצלחת תרבית סטרילית בעלת 24 בארות. פעולה זו תמנע מהשתלים להיצמד לפלסטיק. לאחר מכן, שפכו כ-שניים עד שלושה milliliters לתחתית של שתי צלחונות פטרי בקוטר 360 millimeter וסובבו בעדינות לפיזור.

אלו ישמשו כצלחות ניתוח, והאגאר מונע מהעוברים להידבק לפלסטיק. לאחר הסרת הממברנות שלהם, וכאשר האגאר התקרר והתקשח, חממו בלהבה את קצהו של פיפט מרעה באורך שישה אינץ' עד שיימס לכדור. חממו שוב את הכדור לזמן קצר, ואז געו בו קלות על פני השטח של האגאר בתוך באר של פלטת התרבית.

פעולה זו תיצור שקע רדוד שבו ימוקם ה-X explan. חזור על הפעולה עבור כל באר בפלטה. לאחר מכן, מלא כל באר בפלטת התרבית ב-1 mL של מצע גידול סטרילי בריכוז one x.

לאחר מכן, מלאו את צלחת הניתוח ב-0.1 XMBS כדי להקל על הפרדת העטיפות (blasters). ברגע שצלחות הניתוח מוכנות, העבירו את הביצים המופרות לאחר הסרת מעטפת הג'לי לצלחות פטרי של 100 מילימטר המכילות 0.5 x מצע גידול. ביצים שלא נעשה בהן שימוש מיידי ניתן לגדל בטמפרטורה של 14 degrees Celsius, בזמן שסורקים את הצלחת הראשונה לאיתורו של עובר בשני תאים.

סקרו את העוברים בצלחת הפטרי הראשונה באמצעות מיקרוסקופ דיסקציה והעבירו, בעזרת פיפטת העברה מפלסטיק, כ-10 עוברים בשלב תא אחד ושני תאים לצלחת נפרדת המלאה ב-0.5 x culture.Medium. הניחו את צלחת הפטרי באינקובטור בטמפרטורה של 14 degree Celsius. יכולתו שלבדיקה זו להעריך במדויק את הפוטנציאל ההתפתחותי של תא נשענת על ביצוע דיסקציה של הבלסטומר הנכון בהתבסס על מפות גורל (fate maps).

לפיכך, חיוני לבחור עוברים עם דפוס פיגמנטציה נכון בשלב שני התאים, אשר תואמים בהמשך לדפוסי פילוג רגילים. כפי שמוצג כאן, פילוגים רגילים מתרחשים לעיתים קרובות רק בצד אחד של העובר.

ניתן להשתמש בעוברים אלו כתורמים אם התא התורם מקורו בצד הרגיל. כאשר העוברים מגיעים לשלב שני התאים, יש להעביר לכלי נפרד את העוברים שבהם חריץ ההפרדה הראשון חוצה את האזור בעל הפיגמנטציה הקלה בהמיספריה האנימלית (animal hemisphere); יש למיין פי חמישה בערך מכמות העוברים המיועדים להדסקה. אלו ישמשו כתורמים עבור האקספלן (explan).

שמרו את שני העוברים בשלב תא אחד בצלחת נפרדת לצד העוברים התורמים לאורך הפרוצדורה, כדי שישמשו כביקורת אחים לקביעת שלב ההתפתחות של האקספלאנט (explan). לאחר מיון ודיסקציה של העוברים, חזרו למנות באינקובטור כדי למצוא עוברים נוספים בשלב תא אחד ושני תאים. מכיוון ששעתו של עובר בשלב תא אחד להתחלק היא כ-90 דקות, ניתן לבצע זאת עד שעתיים לאחר איסוף הביציות.

להכנת הדגימה, העבירו חמישה עד 10 עוברים לצלחת ניתוח. לאחר מכן, מקמו את העובר הראשון כך שניתן יהיה לתפוס את קרומי הויטלין השקופים בעזרת פינצטה. בדרך כלל לא ניתן לראות אותם, אך ניתן לתפוס אותם בקוטב האנימלי, שם הם מופרדים על ידי חלל פניני צלול מעל פני העובר.

באמצעות פינצטה מחודדת ביד אחת, אחזו במרחק מהבלאסטר (blaster) המיועד לנשף כדי להימנע מפגיעה בו. לאחר מכן, בעזרת פינצטה מחודדת ביד השנייה, אחזו בממברנה קרוב לקצה הפינצטה הראשונה ומשכו בעדינות לכיוונים מנוגדים כדי לקלף את הממברנה. העובר ישטח לאחר הסרת הממברנה.

בשלב הבא, תפסו תא שכן בעזרת הפינצטה והשתמשו בתא זה כידית, כך שהתא המיועד לדיסקציה לא יינגע ישירות עם הפינצטה שביד השנייה, ומשכו בעדינות את שאר התאים השכנים הרחק מהבלסטמר המבוקש. אם המטרה היא תאי קו אמצע בעלי גורל זהה, ניתן להסירם יחד כזוג. לבסוף, בצעו דיסקציה להסרת תא הידית.

הסר את זוג הבלסטומרים (blastomeres) באמצעות פיפטת זכוכית סטרילית, תוך הימנעות מבועות אוויר ושאיבה מוגברת. מקם את קצה הפיפטה מתחת לפני השטח של מצע התרבית בבאר של צלחת תרבית X, והנח בעדינות את הבלסטומר. הוא אמור להחליק לתוך השקע הרדוד בעזרת כוח הכבידה.

ניתן לשלב blastomeres מיותרים מיותר ממספר עוברים בתוך explan בודד על ידי הנחתם באותה שקע בתרבית. נחזור על פעולה זו עם שאר העוברים בצלחת הדיסקציה, אחד אחד. לאחר כ-10 עוברים, צלחת הדיסקציה תהיה מלאה בשאריות תאיות.

כאשר הדבר קורה, עברו לצלוחית דיסקציה הבאה. לאחר סיום כל הדיסקציות, בדקו אם האקספלנטים נמצאים בשקעים הרדודים. אם לא, ניתן לדחוף אותם בעדינות אל תוך השקע באמצעות לולאת שיער שעברה עיקור ב-70% Ethanol ויובשה באוויר. הדגרימו את השתלים בטמפרטורת החדר על ספת המעבדה למשך כשעה לאחר הדיסקציה האחרונה.

הסר פסולת מהסביבה של האקספלאנט (explant) המורפא בעזרת פיפטת זכוכית סטרילית. הנח את צלחת האקספלאנט בטמפרטורה של 14 עד 20 °C לצד פטריית הפטריי שבה נמצאים עוברי הביקורת (sibling control embryos). העוברים הללו ישמשו להערכת שלב ההתפתחות של האקספלאנט של הבלסטמה.

לאחר כשעה עד שעתיים בתרבית, הבלסטומרים שהוצאו יעברו כארבעה חלוקות וישילו את מרבית השאריות שנותרו מתאים שכנים פגועים. לאחר 20 שעות, הם יגבשו כדורי תאים קטנים וחסינים. כאשר הדגימות מגיעות לשלב ההתפתחותי הרצוי, קצרו את השתל.

אקספלנטים אלו שורדים היטב, גם אם חלק מהתאים מתפרקים. לכן, אם קיימת מסה עכורה בתרבית, נבדוק אותה בעזרת לולאת שיער או פינצטה כדי לקבוע אם אקספלנט בריא קבור בתוכה. נאסוף את האקספלנט בנפח קטן של תמיסת תרבית באמצעות פסטורת זכוכית ונשfיף אותם בעדינות אל תוך מקבע או בופר ליזיס המתאימים לבדיקה המתוכננת.

שני עוברי blasphemers גבונים או שני עוברי blasphemers בטניים הופרדו בשלב 16 התאים ותורבדו בתמיסת XMBS אחת בטמפרטורה של 14 °C עד שעוברי האחים הגיעו לשלבים מוקדמים של לוח העצבים. כל דגימה נבדקה לבדיקת ביטוי של הגן Sox2 בלוח העצבים הזיגותי באמצעות היברידיזציה במקום (in situ hybridization), הנראה כתוצר תגובה כחול.

תוצאות בדיקה זו מוכיחות כי רוב התאים הבלסטמטיים הגביים של בעלי החיים, המהווים את אבותיהם של לביב העצבים, מסוגלים לבטא SOX2 באופן אוטונומי. כלומר, ללא סיגנלינג נוסף מאזורים אחרים של העובר. תאים שאינם מבטאים SOX2 עשויים להיות מזוהים באופן שגוי במועד הנתיחה.

בניגוד לכך, אף אחד מה-animal blasphemers הוונטרליים, המהווים קדמונים של האפידרמיס הוונטרלי, אינו מבטא SOX two. נתונים אלה מצביעים על כך שביכולתם המובנית של ה-animal blasphemers הדורסליים להיווצר רקמה עצבית, בעוד של-animal blasphemers הוונטרליים אין יכולת זו. חלק מה-explan הדורסליים הראו גם התארכות מורפולוגית המעידה על היווצרות מזודרם דורסלי.

בלסטומרים אלו נועדו להוות את מערכת העצבים במערכת העוברית השלמה, ובתרבית מבודדת הם מבטאים חלבון מסמן של מערכת העצבים כדי לבחון את ההשפעה של שינוי הרמות האנדוגניות של גן עצבי המבטא ברמה האימהית. mRNA של Fox D5 הוזרק לבלסטומרים של קדמון הבטן בשלב שמונה התאים. כפי שמוצג כאן, מרבית השתילים הגבאיים ביטאו SOX2.

לעומת זאת, כאשר הרמה האנדוגנית של Fox D5 הופחתה על ידי הזרקת antisense morph oligonucleotides לתאי הקדמון הגבאיים בשלב שמונה התאים, רק מספר מצומצם של תאי הגב הביעו SOX2. ניסויים אלה מעידים כי הביטוי האימהי של Fox D5 ממלא תפקיד ביכולתם האינהרנטית של תאי הקדמון הגבאיים לרכוש גורל עצבי לפני הליך זה. ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון הזרקה לעוברים המיועדים לניתוח של mRNAs לצורך הגברת תפקוד (gain of function) או antisense morph oligonucleotides לצורך הפסדת תפקוד (loss of function), כדי לענות על שאלות נוספות.

לדוגמה, אילו גנים מעורבים ביכולתם האינמינית של תאים להוביל לגורל התפתחותי ספציפי? בנוסף, ניתן לבחון גורמי איתות ידועים על ידי הוספת גורמים מנוקים למצע התרבית. גישה זו יכולה לשמש גם להשתלה של תאים בודדים למיקומים חדשים בעובר השלם.

בדיקה זו בוחנת האם התא המושתל מחויב לגורלו ההתפתחותי המקורי; מידע זה הוא קריטי להגדרת המנגנונים התאיים שבאמצעותם תא עוברי פלוריפוטנטי הופך למחויב לשמש כקדם-תא של רקמה מוגדרת.