Cut-טעינה: כלי שימושי לבחינת היקף Coupling צומת גאפ נותב בין הנוירונים רשתית

המטרה הכללית של ניסוי טעינת החיתוך הבא היא לבחון את מידת הצימוד של סמן (tracer) דרך צמתי פער (gap junctions) בין נוירונים ברשתית שלמה תחת תנאי תאורה מבוקרים. השלב הראשון משיג זאת על ידי חיתוך רשתית עם להב חד טבול בתמיסת neuro biotin, מולקולת סמן שיכולה להתפשט דרך תעלות פתוחות של צמתי פער, אך לא דרך ממברנות של תאים. בשלב השני, הרשתית עוברת אינקובציה בתמיסת Ringer, המאפשרת דיפוזיה של הסמן דרך תעלות פתוחות של צמתי פער.

אם הצימוד דרך צמתי פער (gap junction) הוא חלש, הפלואורסצנציה של ה-neuro biotin תהיה מוגבלת לנוירונים רטינליים הנמצאים בקרבת החתך. לעומת זאת, אם הצימוד דרך צמתי הפער הוא חזק, הפלואורסצנציה תגלה בנוירונים רטינליים הרחוקים מהחתך. היתרון המרכזי של שיטת טעינה באמצעות חתך (cut loading) על פני טכניקות קיימות הוא שקל יותר לבצעה בנוירונים בעלי גוף תא קטן ברקמה רטינלית עצבית שלמה.

קל יותר לשלוט בתנאי התאורה במהלך טעינת החתכים מאשר במהלך מחקר אלקטרופיזיולוגי של נוירונים בודדים ברקמת רשתית שלמה. מכיוון שגירויי האור המשמשים במהלך ההקלטה החשמלית יכולים בעצמם להוביל לשינויים בצימוד של צמתי הפער (gap junction coupling), הטכניקה תודגם על ידי ד"ר Chu Choi, פוסט-דוקטורנט מהמעבדה שלי. בהליך זה, דג זהב נשמר בחשיכה מוחלטת במהלך היום למשך שעה אחת לפחות לפני הניתוח, וכל השלבים הבאים עד לקיבוע רקמת הרשתית מבוצעים גם הם במהלך היום בחשיכה מוחלטת; הרדמו את דג הזהב עמוקות על ידי הוספת 150 milligrams per liter של methane sulfonate למי האקווריום.

לאחר מכן, יש להקריב את דג הזהב בהתאם להנחיות הפדרליות והאוניברסיטאיות ולהוציא את גלגלי העיניים בזהירות. בשלב הבא, הסירו את החלק הקדמי של כל גלגל עין. לאחר מכן, הניחו פיסת נייר סינון על החלק האחורי של העין והפכו את נייר הסינון ואת העין כך שנייר הסינון יהיה מתחת לחלק האחורי של העין.

כעת, הסר בעדינות את החלק האחורי של העין, כולל הסקלרה (קשתית) ואפיתל הפיגמנט, מהדג זהב שהותאם לחושך. גזור את העצב האופטי של הרשתית באמצעות מספרים עדינים. את רשתית דג הזהב העצבית, כאשר צד הפוטורצפטורים פונה כלפי מעלה, יש להצמיד כעת לנייר סינון לפני הוצאת העין, בעוד הדג נמצא תחת הרדמה ב-5 mL של תמיסת רינגר מבוססת פחמות מחומצנת, עם או בלי תרופה לבדיקה, בכל באער של פלטת 6 באערים, לאחר הפרדת הרשתית העצבית השלמה מהחלק האחורי של העין.

העבירו את הרשתיות לבארות בתנאי חשיכה קבועה. לאחר מכן, אטמו את הבארות באמצעות פאראפורם והניחו לרקמה להדגירה למשך 30 דקות. הכינו 100 µL של תמיסת סמן על ידי המסת 0.5% neuro biotin בתמיסת רינגר מיד לפני החיתוך של הרשתית.

בשלב הבא, העבירו את תמיסת ה-neuro biotin לצלוחית פטרי מזכוכית. לאחר מכן, הקישו בעדינות על נייר הסינון שאליו מחוברת הרשתית על גבי מגבת נייר. כדי להסיר שאריות של תמיסת ringers, טבלו להב תער תמיסת neuro biotin ובצעו חיתוך רדיאלי בניצב דרך הרשתית ונייר הסינון.

לאחר מכן, טבול את להב התער בינוביוטין (neuro biotin) שוב וחתור ברשתית פעם שנייה. חזור על פעולה זו עד לארבעה חתכים לכל רשתית. בשלב זה, העבר את הרשתית לתמיסת רינגר (ringers) טרייה, מצע עם או בלי התרופה הנבדקת, למשך 15 דקות כדי לאפשר טעינה ודיפוזיה.

שטוף זאת שלוש פעמים בתוכלי רינגר (ringers) רעננים, עם או בלי התרופה הנבדקת, למשך חמש דקות בכל פעם. לאחר מכן, קבע את הרשתית באמצעות 4% para formaldehyde בתמיסת בופר פוספט 0.1 molar בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. לאחר מכן, שטוף את הרשתית ב-0.1 molar PBS למשך הלילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס על ידי הנחתה במקרר עד ליום למחרת.

הגבו את הרשתית עם 2% streptavidin Alexa 4 88 ב-0.1 molar PBS ו-0.3% Triton X 100 לריכוז סופי של 10 micrograms per milliliter, והדגרירו למשך לילה בטמפרטורה של ארבע degrees Celsius. למחרת, שטפו את הרשתית שלוש פעמים עם 0.1 molar PBS בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות בכל פעם.

הפרידו את הרשתית מנייר הסינון ב-PBS. לאחר מכן, באמצעות מברשת עדינה, העבירו את הרשתית לשקף עם מדיום קיבוע מסוג vector shield, כאשר צד הפוטורצפטורים פונה כלפי מעלה. העבירו את השקף למיקרוסקופ קונפוקלי סורק בלייזר וצלמו תמונות באותה רזולוציית הגדלה והגדרות עבור כל תנאי ניסוי, כדי שניתן יהיה להשוות את השפעותיהם של תנאי ניסוי שונים על מידת הצימוד של הסמן התפקודי במרווחים (gap functional tracer coupling).

להלן היקף הצימוד של סמן תאי פוטורצפטורים במהלך היום בחשיכה קבועה, בהשוואה ליום בחשיכה קבועה בנוכחות של מעכב סלקטיבי של קולטן דופמין D2. שימו לב שהחתך של התער בשני התמונות נמצא משמאל. למרות שתמונה אחת עשויה להכיל את כל התאים המסומנים, מומלץ לאסוף Z-stack של האזור הרלוונטי ולמזג אותו לתמונה אחת כפי שמוצגת.

כאן מוצג היקף הצימוד של סמן תאי פוטורספטורים בעת תנועה רצופית דרך נתח Zack כזה. שימו לב כי החיתוך של התער בבבדירה זו נמצא מימין. כדי לכמת את היקף צימוד הסמן בדפדפן תמונות ה-LSM, פתחו את התמונה, לחצו על export ושמרו את התמונה כקובץ TIF 16 bit לא דחוס; יש לכלול סרגל קנה מידה בתמונת TIFF זו באמצעות תוכנת NIH image J.

מדוד את עוצמת הפלואורסצנציה של neuro biotin המסומן ב-Alexa 488 מתמונות בהגדלה נמוכה של רשתות עיניים המעוגנות כשלמות (hole mount). פתח את קובץ ה-TIFF באמצעות תוכנת Image J ולאחר מכן שרטט קו ישר התואם לסרגל המقياس (scale bar). לאחר מכן, עבור ל-analyze, בחר ב-set scale, והזן את המרחק הידוע ואת יחידת האורך.

לאחר מכן לחצו על אישור. כעת ניתן להציג את מדידות הפלואורסצנציה ביחידות מכויילות כגון מילימטרים. לאחר מכן, בחרו את האזור הרלוונטי באמצעות כלי הבחירה המלבני.

יש למקם את שיא הפלואורסצנציה בגבול השמאלי של הבחירה. ודאו שאין אות פלואורסצנציה ליד הגבול הימני. לחצו על analyze and plot profile עבור נתוני בקרת היום שהתקבלו בחשיכה קבועה.

עקומה בעלת דעיכה מעריכית מוצגת משמאל לימין. לאחר מכן, לחצו על copy בחלון הקופץ והדביקו אותה ב-Excel. כעת מופיעות שתי עמודות, אחת המציגה את המרחק מהחתך והשנייה המציגה את עוצמת הפלואורסצנציה כפונקציה של המרחק מהחתך.

לצורך השוואה, השלבים לעיל חוזרים על עצמם עם נתונים שהתקבלו בחשיכה רציפה במהלך היום. בנוכחות spit bro, חלקו כל ערך פלואורסצנציה גולמי בערך הפלואורסצנציה המקסימלי כדי לקבל את עוצמת הפלואורסצנציה היחסית. העתיקו שתי עמודות המתאימות למרחק מהחתך ולעוצמת הפלואורסצנציה היחסית, ולאחר מכן הדביקו אותן בתוכנת origin.

שלבים אלו מוצגים הן עבור בקרת היום והן עבור יריקת היום. נתונים שהורצו בנקודה זו מתאימים את התוצאות לפונקציית דעיכה מעריכית מספר אחת, והשוואת ערכי קבוע המרחב בתנאים ניסויים שונים מבוצעת באמצעות T-test או Inova.

פונקציות מעריכיות וניתוחים סטטיסטיים של נתוני ביקורת בזמן היום, נתוני pip rone בזמן היום, ונתוני ביקורת בזמן הלילה מוצגים לצורך השוואה. מוצגות כאן דוגמאות להיקף הצימוד של חומר מעקב (tracer) בתאי פוטורספטור ברשתית של דג זהב המותאם לחושך ביום A, בלילה B, ובמהלך היום בנוכחות של one, אנטגוניסט סלקטיבי לקולטן דופמין D two, כפי שנחשף באמצעות טכניקת ה-cut loading. כל תמונות הקונפוקאל צולמו באמצעות אותן הגדרות לצורך השוואה.

בגרף זה, עוצמת הפלואורסצנציה עבור שלושה תנאים ניסיוניים מוצגת כפונקציה של המרחק מהחתך ומותאמת באמצעות פונקציה מעריכית. טכניקת טעינת החתך (cut loading) משמשת לכימות מידת הצימוד של סומני צמתי פער (gap junctional tracer coupling) על ידי חישוב ערכי קבוע המרחב, כפי שמוצג כאן עבור שלושה תנאים ניסיוניים. ניתן להשתמש בטכניקת טעינת החתך גם כדי לחקור סינפסות חשמליות בין סוגי תאים אחרים ברשתית ובמינים אחרים.

לדוגמה, שתי איורים אלה ממחישים כי תאי אופקיים מסוג A ומסוג B בארנבת מראים צימוד של סמן הומולוגי בעקבות טעינה בחיתוך (cut loading) ודיפוזיה של neuro biotin בתנאי הסתגלות לחושך. השתמשנו בטכניקת הטעינה בחיתוך כדי לבחון את היקף דיפוזיית הסמן דרך צמתי הפער (gap junctions) בין הפוטו-רצפטורים מסוג rods ו-cones ביום ובלילה. בנוסף, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לקבוע האם הצימוד של סמנים בין נוירונים רטינליים אחרים נשלט על ידי השעון הרטינלי ו/או על ידי תנאי אור וחושך ספציפיים.

ניתן להשתמש בו גם כדי לחקור צימוד של סמנים (tracer coupling) בין נוירונים באזורי מוח אחרים.