הצמד תיקון הקלטות מתא עצב עכבר רשתית בהכנת Dark המותאמות פרוסה
12 בספטמבר 2010
כאן אנו מתארים את הליך להפקת כהה מותאם פרוסות של הרשתית העכבר על הקלטות אלקטרו.
החוויה החזותית שלנו מתחילה כאשר הפיגמנט החזותי בפוטורצפטורים של הרשתית סופג פוטונים של אנרגיית אור, מה שמוביל בסופו של דבר לסגירה של תעלות המופעלות על ידי נוקלאוטיד ציקלי בממברנת התא. פעולה זו מדכאת את שחרורו של הנוירוטרנסמיטר glutamate הן מהמקלות והן מהקונוסים. ה-glutamate המשוחרר מזוהה על ידי תאי רשתית במורד המסלול כדי לחקור את האותות הבאים לאחר מכן.
העיניים מוסרות מעכבר שהורדם. ה-S מבודלים, מוטמעים בבלוק אגר ונחתכים באמצעות מיקרוטום רוטט. לאחר מכן, פרוסות הרשתინა מונחות תחת מיקרוסקופ ועוברות גירוי באמצעות תאורת LED.
בזמן זה מתבצעות הקלטות patch clamp למדידת הזרמים או הפוטנציאלים הסינפטיים הנוצרים. בדרך כלל, אנשים שאינם מכירים את השיטה יתקשו בביצועה בשל המורכבויות הנוספות הכרוכות בעבודה בחשיכה. לכן, היכולת להמחיש את התהליך כולו תעניק תחושה שקשה לתאר בדרכים אחרות.
התחילו את הפרוצדורה על ידי ציפוי אלקטרודות תיל ההקלטה והייחוס שבהן תשתמשו בשכבה של כסוף כלוריד. טבלו את האלקטרודות בנתרן כלוריד בריכוז 1 M. לאחר מכן, באמצעות מקור מתח של 15 volt עם גל סינוס בתדר של 1 hz, העבירו ביניהן מתח של 15 volt למשך כ-20 שניות.
באמצעות מכשיר למשיכת מיקרו-פיפטות, הכין פיפטות ל-patch מזכוכית סיליקה BO שעברה ליטוש באש, תוך בחירת התנגדות של קצה הפיפטה בהתאם לגודל תאי המטרה עבור גופי תא בקוטר של כ-20 מיקרון. השתמש בפיפטה בעלת התנגדות קצה של 5 עד 10 mega ohms עבור גופי תא. עבור גופי תא בקוטר של כ-5 מיקרון, השתמש בהתנגדות קצה של 12 עד 15 mega ohms.
להכנת אלקטרודות הייחוס של הקרקע, השתמש במזרק כדי למלא צינור פוליאתילן בתמיסת agar בריכוז 3.5% שהוכנה בנתרן כלוריד בריכוז one millimolar. לאחר מכן, הכן את התמיסות הבאות בהתאם להוראות בפרוטוקול הכתוב המצורף: תמיסת אמבט חיצונית, תמיסת חיתוך, תמיסה פנימית לפיפט potassium aspartate, ומחסום ה-agar.
יש לאחסן את כל התמיסות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עד למועד השימוש. ביום הניסוי, יש להוסיף כ-1.5 milliliters של תמיסה פנימית של potassium aspartate. לאחר מכן, יש להוסיף Fluor מדולל.
שפכו כ-50 milliliters של מצע aims המכיל sodium bicarbonate לתוך מכל אחסון אטום לאור. חברו את צינור הפלסטיק למכל גז המכיל 5% carbon dioxide ו-95% oxygen כדי להגיע לשיווי משקל בין מצע ה-aims לגז, ולאחר מכן הניחו את המכל באמבט מים בטמפרטורה של 30 עד 32 degrees Celsius. לאחר מכן, מלאו בקבוק ב-110 milliliters של מצע aims המכיל he peas והניחו אותו על קרח.
יש להשוות את המדיום על ידי הבעבוע של התמיסה עם גז oxygen 100%. העבירו את שארית מדיום aimes המכיל sodium bicarbonate למאגר מחומם שמעל כלוב פאראדיי. עטפו את הצינורית ופיית הבקבוק ב-paraform כדי ללכוד גז בחלל שמעל התמיסה ולהגיע לשיווי משקל עם 5% carbon dioxide ו-95% גז oxygen.
באמצעות צינור פיזור אוויר מזכוכית, הכין אגר בטמפרטורת ג'ל נמוכה בריכוז 3% על ידי הוספת 0.75 גרם ל-25 מיליליטר של מצע aims תוך חימום. חמם את התמיסה לערך של 115 מעלות צלזיוס תוך כדי ערבוב. כאשר התמיסה הופכת שקופה וללא בועות, העבר את תמיסת האגר המומסת למקלח מים בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס.
הקימו את תא ההקלטה על המיקרוסקופ ההפוך. החליקו גשר אגר באורך חמישה סנטימטרים מעל אלקטרודת הייחוס מסילבר/סילבר כלוריד ומקמו אותו בתא ההקלטה. ניתן למדוד את התנגדות קצה הפיפטה על ידי מילוי פיפטה בתמיסה פנימית, הנחתה על מחזיק הפיפטה, הכנסת מחזיק הפיפטה לשלב הראש של המגבר, והורדת הפיפטה אל תוך התמיסה. כדי לשמר את הפיגמנט הראייתי עבור הקלטות פיזיולוגיות, יש לבצע את כל הפרוצדורות תחת אור אינפרא-אדום תוך שימוש במשקפי אינפרא-אדום, אך כל הפרוצדורות יוצגו כאן באור חדר.
לאחר ביצוע ההדשתו של העכבר, השתמש במספריים קמורות כדי להוציא במהירות את העיניים. הנח את העיניים על פיסת נייר סינון כדי למנוע מהן להתגלגל. לאחר מכן, החזק עין אחת במקומה בעזרת פינצטה והשתמש בלהב דק דו-צדדי כדי לבצע חתך בקרנית.
ברגע שגלגל העין ננקב, העבירו את העין למנתra פטרי בקוטר 60 מילימטר הממולאה בתווך aims. בעזרת החריץ בקרנית כנקודת כניסה, השתמשו במספריים קטנים כדי לגזור את חלקי הקרנית הנותרים.
לאחר מכן הסר את העדשה ואת הגוף הזגוגית, תוך וידוא שהרשתית נשארת מחוברת לגביע העין. הנח אותה במכל אטום לאור המלא במדיום aims, ששיווי משקלו בוצע עם 5%carbon dioxide ב-95%oxygen בטמפרטורה של 32 degrees celsius.
בצע חיתוך רוחבי של אחת מגביעי העין באמצעות להב סקלפל מספר 10. הפרד את הרשתית מהאפיתל הפיגמנטי של הרשתית.
הסר את קצוות הרשתית כדי לאפשר לרקמה להישאר שטוחה. השתמש בפיפטת פסטורי זכוכית קטנה עם בלונית לטקס כדי למלא צלחת פטרי של 35 מילימטר באגר עם טמפרטורת ג'לטינציה נמוכה מומס, והעבר את הפינצטה דרך האגר כדי לבדוק את הסמיכות שלו. ברגע שהאגר מתחיל להתמצק, העבר את הרשתית לחלקו העליון של האגר.
לאחר מכן, ללא מגע עם הרשתית, השתמש בחתיכה מקופלת של נייר ניגוב מסוג Kim wipe כדי לספוג את עודפי התמיסה שסביבה. טפטף שתי עד שלוש טיפות נוספות של אגר ישירות על הרשתית והנח במהירות גליל פלסטיק כדי ליצור דופן סביבה; תוך שמירה על הרשתית קרוב למרכז הגליל, טפטף אגר מומס נוסף, והעבר את צלחת הפטרי לאמבט מי קרח לצורך קירור. לאחר 30 שניות, הוצא את הרקמה והשתמש בבוכנה כדי לדחוף החוצה את בלוק האגר, תוך לחיצה מהצד הרחוק ביותר מהרשתית.
השתמשו בלהב תער חד-צדדי כדי לחתוך קובייה קטנה של אגר הכוללת את הרשתית, והדביקו את הקובייה בעזרת דבק מהיר (super glue) אל מעצור האגר בדיסק הדגימות. העבירו את דיסק הדגימות למעמד המיקרוטום הרוטט ושפכו לתוך המעמד תמיסת AIMS קרה מאוד, כך שהקובייה עם הרשתית תהיה טבולה לחלוטין. חתכו פרוסות רשתית בעובי של כ-200 microns תוך שימוש בקצב הרטט המקסימלי של הלהב, כאשר מהירות התקדמות הלהב מוגדרת כך שארכה של חיתוך בודד דרך הרשתית הוא ארבע עד חמש שניות.
השתמשו בלהב סכין מנתחים מספר 11 כדי לחתוך מהבלוק כל פרוסה שמיחה אחת לאחר השנייה. הניחו את הפרוסות המכילות את הרשתית בתאי רישום וקבעו אותן. השתמשו בעוגני פרוסות כאשר חוטי הניילון חוצים את עוגן הפרוסה.
החזיקו את האגר המקיף את הרשתית, כך שהרשתית תישאר ללא חסמים. לצורך ההקלטות, העבירו את תא ההקלטה אל הבמה של המיקרוסקופ הזקוף.
סגרו את הווילון והדליקו את מקור האור באינפרא-אדום כדי לצפות בחתך באמצעות מצלמה הרגישה לאינפרא-אדום. תחת המיקרוסקופ, זהו חתך רשתית עם פוטורצפטורים שלמים בזווית החיתוך המתאימה. ייתכנו נזקים שטחיים מסוימים כתוצאה מתהליך החיתוך.
בעזרת פיפט עם קצה שבור, שאבו בעדינות את גופי התאים המתים. כדי להסיר שכבה דקה זו של תאים, לאחר ששכבה בריאה של תאים חיים נחשפה, זהו גוף תא שנמצא בשכבות המעניינות את המחקר. העבירו את קצה הפיפט כך שייצור שקע בממברנת התא, והפעילו לחץ שלילי עדין (כלפי פנים) כדי ליצור אטימה בעלת התנגדות גבוהה. ניתן להגיע למצב תא שלם (Whole cell mode) על ידי הפעלת לחץ שלילי על האלקטרודה כדי לפרוץ אל תוך התא.
לאחר מכן, גרה את רקמת הרשת באמצעות אור באמצעות נוריות LED כדי לעורר תגובות. בסיום ההקלטה, צלם תמונה באמצעות אור העירור המתאים עבור ה-Fluor שדיפוזיונל (dialyzed) אל התא מהתמיסה הפנימית של הפיפטה. כאן מוצגים פוטנציאלים מעוררי אור של נוירון רשת שעבר הסתגלות לחושך, בתגובה להבזקי אור בעוצמה עולה.
איור זה הוא תמונת פלואורסצנציה שצולמה מפרוסה רשתית שבה התאים מולאו ב-Fluor Lucifer yellow; הפלואורסצנציה שהתעוררה מראה את המורפולוגיה של התאים מהם בוצעו הקלטות patch. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה יותר של חלק מהמורכבויות הכרוכות בביצוע הקלטות patch clamp מפרוסות רשתית שהותאמו לחושך. מטרת הליך זה היא למדוד תגובות המעוררות על ידי אור תחת תאורה מבוקרת.
על מנת לעשות זאת, עלינו תחילה לבודד את הרשתית, להטמיע אותה באגר (agar), ולאחר מכן להכין פרוסות רשתית מהן נוכל לבצע הקלטות של תאים בודדים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר פרוצדורה להפקת פרוסות רשתית של עכבר המותאמות לחושך, שהן חיוניות להקלטות אלקטרופיזיולוגיות. שיטה זו מאפשרת לחוקרים ללמוד את נתיבי השליחון בתאי הרשתית בעקבות גירוי של אור.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- אלקטרופיזיולוגיה
- ביולוגיה של הרשתית
רקע
- התהליך החזותי מתחיל בספיגת אור על ידי פוטורצפטורים ברשתית.
- פוטוטרנסדוקציה מובילה לשינויים בשחרור מוליכים עצביים.
- הבנת מנגנונים אלו חיונית להשגת תובנות לגבי עיבוד חזותי.
- מודלים של עכברים נמצאים בשימוש נפוץ במחקרי רשתית.
מטרת המחקר
- מתן פרוטוקול מפורט להכנת פרוסות רשתית של עכבר.
- סיוע בביצוע הקלטות אלקטרופיזיולוגיות בתנאי חשיכה.
- שיפור ההבנה של מסלולי העברה סיגנלית ברשתית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בידוד עיניים מעכברים שהורדמו.
- הטמעה של דגימות רשתית בבלוקים של אגר.
- חיתוך באמצעות מיקרוטום רוטט.
- גירוי של הפרוסות באמצעות תאורת LED תחת מיקרוסקופ.
תוצאות עיקריות
- הפקה מוצלחת של פרוסות רשתית המותאמות לחושך.
- יכולת להקליט תגובות אלקטרופיזיולוגיות מתאי רשתית.
- הדגמה של דיכוי שחרור גלוטמט בתגובה לאור.
- תובנות לגבי סיגנלינג במורד המסלול בנתיבי הרשתית.
מסקנות
- השיטה המתוארת יעילה לחקר פיזיולוגיה של הרשתית.
- רישומים אלקטרופיזיולוגיים יכולים לספק נתונים בעלי ערך על תפקוד הרשתית.
- ניתן ליישם גישה זו במגוון מחקרים במדעי המוח החזותיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג ניהולי
פרוטוקול זה מאפשר מדידה מדויקת של תגובות אלקטרופיזיולוגיות המושרות על ידי אור בנוירונים של הרשתית בתנאי הסתגלות לחושך, ובכך תומך בתיקוף של מטרות במדעי העצבים הויזואליים. באמצעות שימור תפקוד הפוטורצפטורים וצמצום הלבנת הפיגמנטים, הוא משפר את מהימנות הנתונים לצורך הפחתת סיכונים מכניסטיים של היפותזות טיפוליות. גישה זו מספקת מערכת רלוונטית למחלה להערכת השפעות של תרכובות על מסלולי אותות ברשתית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר חקירה של מנגנוני פוטוטרנסדוקציה (phototransduction) ותיקוף תפקודי של מטרות ברשתית.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות מדידה הדירה של זרמים סינפטיים ושינויים בפוטנציאל הממברנה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- ערך מדעי: ייצור פרוסות רשתית סטנדרטיות בעלות תגובות חזקות למשפיעי אור לצורך סריקה עקבית של תרכובות.
- ערך תפעולי: מקל על הכנת הבדיקה באמצעות חיתוך במיקרוטום רטט וויזואליזציה באינפרא-אדום למיקוד האלקטרודות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- ערך מדעי: מספק מערכת רלוונטית למחלה להערכת השפעות של תרכובות על שחרור גלוטמט ואיתות רטינלי במורד הזרם.
- ערך תפעולי: מאפשר רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים להכנת פרוסות ולגירוי.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
השיטה משתלבת בתהליכי עבודה של גילוי מוקדם על ידי מתן אפשרות לבדיקת השערות לגבי מטרות ברשתית ותמיכה בזיהוי מובילים באמצעות קריאות פונקציונליות.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בהבהרה של מסלולים על ידי מדידה של שינויים בפוטנציאל ממבנה הממברנה של פוטורצפטורים המעוררים על ידי אור ופעילות נוירונלית במורד המסלול.
- סריקה: מספקת פלטיים כמותיים כגון אמפליטודות של זרם סינפטי ופוטנציאלים המעוררים על ידי אור לצורך השוואת תגובות לתרכובות.
- אנליטיקה: מאפשרת ניתוח סטטיסטי של הקלטות אלקטרופיזיולוגיות להערכת השפעות תלויות-מינון ו modulate של מסלולים.
- מחקר תרגומי: מקשר לרציפות פרה-קלינית באמצעות תנאים סטנדרטיים של הסתגלות לחושך המדמים תפקוד רשתית אנושית.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה לשימוש חוזר להערכת מטרות ברשתית על פני מספר פרויקטים ותחומי טיפול.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזיוי על ידי הפחתת עמימות מכניסטית במסלולי התמרות חזותיות.
- ערך תפעולי: משפר את ההדירות באמצעות הטמעה סטנדרטית באגאר, חיתוך במיקרוטום רוטט ופרוצדורות מונחות אינפרא-אדום.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של go/no-go על ידי אספקת נתונים פונקציונליים מהימנים לגבי מעורבות מטרות רטינליות.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים של תרכובות על בסיס השפעות על שחרור מוליכים עצביים ואיתות רטינליים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באלקטרופיזיולוגיה, דיסקציה של הרשתית וטכניקות patch clamp.
- תלוי במיקרוטום רוטט, מיקרוסקופיה באינפרא-אדום ומערכות גירוי ב-LED.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של הכנת הפרוסות, שיווי המשקל של התמיסות וטיפול במצב של הסתגלות לחושך.
- כולל שיקולי הסתגלות עבור סוגים שונים של תאי רשתית וריכוזי אגר ספציפיים למין.
- מוגבל על ידי משך חיוניות הרקמה והצורך בשימוש מיידי לאחר החיתוך כדי לשמור על מצב של הסתגלות לחושך.
