פלורסנט מיקרוסקופית עצמים ללא עדשה על שבב

המטרה הכללית של הליך זה היא להדגים פלטפורמה למיקרוסקופיה פלואורסצנטית על גבי שבב ללא עדשות, לצורך דימוי של עצמים פלואורסצנטיים בשדה ראייה רחב במיוחד. כדי להשיג זאת, מסנן בליעה דק ולוח פנים של סיב אופטי מונחים בעדינות מעל מערך חיישנים אופטו-אלקטרי, או CMOS CCD, ולאחר מכן שבב מיקרופלואידי ממוקם מעל ללוח הפנים. לאחר מכן, מ Prisma מורכב עם השבב המיקרופלואידי באמצעות שמן להתאמת מקדם שבירה.

עירור פלואורסצנטי מושג דרך הפאה הצדדית של פריזמה רומבואידית, וההארה ההולוגרפית מתבצעת דרך הפאה העליונה של אותה פריזמה. בסופו של דבר, ניתן להפיק תמונות מיקרוסקופיות ברזולוציה גבוהה מהתמונות הפלואורסצנטיות שנרכשו, על ידי פענוח התמונות הגולמיות באמצעות אלגוריתמים דיגיטליים. במידת הצורך, ניתן לספור באופן אוטומטי את האובייקטים הפלואורסצנטיים שפוענכו באמצעות ממשק שפותח במיוחד למטרה זו.

עדשה על שבב (On chip lens). מטרת הדימוג באופן כללי היא להחליף מיקרוסקופים אופטיים מבוססי עדשות ומסיביים במבנים פשוטים וקומפקטיים יותר. לפלטפורמה טכנולוגית מתהווה זו יש פוטנציאל לביטל את הצורך ברכיבים אופטיים מסיביים ויקרים, וזאת באמצעות תיאוריות חדשניות ואלגוריתמים של שחזור דיגיטלי.

רשימת העדשות בפלטפורמת דימוי על-שבב כוללת מספר רכיבים אופטיים, ביניהם מערך חיישנים דיגיטלי, מקור תאורה לא-קוהרנטי, מנסרה, מסנן בליעה, ולוח פנים של סיב אופטי, או קונוס סיב אופטי. בפלטפורמה זו, ניתן להשתמש בסוגים שונים של מערכי חיישנים לצורך זיהוי האות הפלורסצנטי ממיקרו-אובייקטים מטרה. לצורך סרטון זה, ייעשה שימוש במתקן התקן העמדה (CCD), ומקור אור לא-קוהרנטי, כגון דיודה פולטת אור פשוטה, ישמש לעירור פלורסצנציה.

שתי שיטות שונות של סינון עירור משמשות במקביל כדי ליצור את רקע השדה האפל הנדרש, כפי שמוצג בדיאגרמה זו. ראשית, נעשה שימוש במנסרה מזכוכית או בחצי כדור מזכוכית כדי ליצור הח reflection פנימי מלא או TIR במשטח התחתון של השבב המיקרופלואידי המכיל את הדגימות המדוברות. במקביל לכך, נעשה שימוש במסנן בליעה זול כדי להסיר את אור העירור המפוזר באופן חלש שאינו מציית לתהליך ה-TIR.

לאחר דחייה מוצלחת של העירור באמצעות שני מנגנונים אלה, רק הפליטה הפלורסצנטית של הדגימות נקלטת במישור הגלאי. למרות מפתח נומרי גדול כל כך של הגילוי, הכתמים הפלורסצנטיים הגולמיים במערך החיישנים הופכים לרחבים למדי כדי לתכנן ולשלוט טוב יותר בפיזור המרחבי של אות פלורסצנטי זה. לוח פנים של סיב אופטי ימוקם בין מישור האובייקט למישור החיישן כחלופה ללוח פנים רגיל.

לוח פנים של סיב אופטי מדורג, בעל צפיפות גבוהה משמעותית של כבלים אופטיים בפאת העליונה בהשוואה לתחתונה, יכול לשמש להדמיה ברזולוציה גבוהה יותר באמצעות הגדלה. השבבים המיקרופלואידיים המשמשים בפלטפורמה זו מיוצרים באמצעות קירות poly dimethyl Sloane המונחים על שקופיות זכוכית כדי ליצור את המיקרו-תעלות הדרושות להדמיה על השבב, כדי להתחיל בהרכבת פלטפורמת ההדמיה ללא עדשות על השבב. ראשית, הסר את זכוכית הכיסוי של מערך החששנים האופטואלקטרוניים באמצעות עט ואקום, והנח בעדינות מסנן בליעה דק על החלק העליון של האזור הפעיל של הגלאי.

מקמו לוחית פנים של סיב אופטי מעל מסנן בליעה זה. לאחר מכן, הניחו את השבב המיקרופלואידי המיוצר ישירות מעל מערך הסיבים האופטיים. בשלב הבא, הרכיבו מנסה מזכוכית מעל השבב המיקרופלואידי באמצעות שמן להתאמת מקדמים, כך שמקדם השבירה של הממשק יהיה תואם למקדם השבירה של הזכוכית.

חברו את מקורות האור לכבלי סיב אופטי באמצעות מחברי FC. אחד ההיבטים המורכבים ביותר בפרוצדורה זו הוא יישור הרכיבים. יישרו בזהירות את המרחקים בין הרכיבים, את המיקום ואת זווית ההארה.

לבסוף, קרבו את סיב התאורה הצדי אל המנסרה וכוונו את זוויתו כדי להבטיח שהשתקפות פנימית גומללה תתרחש בממשק הזכוכית-אוויר התואם לשבבים המיקרופלואידיים. ניתן לצלם באמצעות פלטפורמה זו על השבב ת substratum תחתון, תאים שונים או מודלים של בעלי חיים קטנים, אך לצורך הדגמה זו יצולמו תאי דם לבנים. כדי לסמן את תאי הדם הלבנים בצבע פלואורסצנטי, ערבבו תחילה כ-100 µL של דם מלא עם כ-1 mL של בופר להסרה של תאי דם אדומים, דגרו למשך כ-3 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן סובבו במרכזית את תמיסת הדם המעובדת.

לאחר הסרת השכבה העליונה באמצעות מיקרופיפט, השהה מחדש את שכבת המשקע בתוך phosphate buffered saline כדי לסמן את החומצות הגרעיניות של התאים בצבע פלואורסצנטי; הוסף SYTO 16 לתמיסת ההשהיה ולאחר מכן הדגר את הדגימה למשך כ-30 דקות בחושך בטמפרטורת החדר. לאחר 30 דקות, סבב במרכזית את הדגימה המסומנת. הסר את העילוי כדי להפחית את רעש הרקע הנובע מפליטה פלואורסצנטית של צבעים שאינם קשורים.

ריס המיסה את שכבת משקע תאי הדם הלבנים בכ-5 mL של PBS. הדגימה מוכנה כעת להעמסה אל השבב המיקרופלואידי לצורך דימות פלואורסצנטי ללא עדשה על השבב. לפני דימות תאי הדם הלבנים, יש לכיול של פלטפורמת הדימות באמצעות מיקרו-חרו지를 פלואורסצנטיים.

הכינו דגימה מדוללת של חרוזי מיקרו (microbeads) באמצעות מים דאיונזים ותמיסת חרוזים גולמית. בעזרת מזרק עם מחט חדה, הזריקו דגימה ראשונית זו אל השבב המיקרופלואידי מהצד של קירות ה-PDMS.

לאחר הרכבת הרכיבים להשגת דימות פלואורסצנטי על השבב, רכשו תמונות גולמיות של חלקיקים פלואורסצנטיים באמצעות ממשק LabVIEW שפותח במיוחד, דרך מחשב. ודאו שקיימות לפחות 20 תמונות של חלקיקים פלואורסצנטיים מבודדים על פני כל שדה הראייה. שמרו את נתוני הכיול, שישמשו מאוחר יותר לכיול ולהוצאה של פונקציית הפיזור (point spread function) של פלטפורמת המיקרוסקופיה הפלואורסצנטית ללא עדשות.

הוציאו את השבב המיקרופלואידי המכיל את דגימת החרוזים הפלואורסצנטיים וניתקו את הפריזמה מהשבב. הזריקו את דגימת תאי הדם הלבנים שהוכנה קודם לכן לתוך שבב מיקרופלואידי אחר שאינו בשימוש, מהצד של דפנות ה-PDMS. הרכיבו את הרכיבים פעם נוספת תחת אותם תנאים ניסיוניים, בדגש על המרחקים ועוצמת העירור.

יש להשיג את התמונות הגולמיות של תאי דם לבנים באמצעות מערכת ה-lab view שהוכנה במיוחד, תוך שימוש באותם פרמטרי תוכנה ששימשו עבור המיקרו-חרו지를 הפלואורסצנטיים. נתוני הכיול ותמונות תאי הדם הלבנים הגולמיות משמשים לאחר מכן ליצירת תמונות ברזולוציה גבוהה יותר ב-MATLAB באמצעות עיבוד דיגיטלי. להשוואה, מוצגות כאן תוצאות מייצגות של דימוי פלואורסצנטי על שבב באמצעות עדשה בשדה רחב של תערובת המכילה חלקיקים פלואורסצנטיים ירוקים בגודל 4 micron ו-10 micron, תחת מיקרוסקופ 10x.

סופקו גם תמונות מאובייקטיב, התואמות היטב לתמונות הפלואורסצנטיות ללא העדשה שהוצגו. לאחר מכן, תוצאות של דימות פלואורסצנטי ללא עדשה בשדה רחב של תערובת המכילה חלקיקים פלואורסצנטיים ירוקים בגודל 10 micron וחלקיקים פלואורסצנטיים אדומים בגודל 10 micron. התמונות הפלואורסצנטיות ללא העדשה מספקות התאמה טובה לתמונות מאובייקטיב של מיקרוסקופ בפי 10x של אותן דגימות.

איור זה מספק השוואת ביצועים בין דה-קונוולוציה של לואי-ריצ'רדסון (Lucy Richardson Deconvolution) לבין דגימה דחוסה (compressive sampling) המבוססת על אלגוריתמי פענוח עבור הדמיה של זוגות חרוזים שונים בגודל 10 מיקרון. השורה העליונה ממחישה את תמונות הפלואורסצנציה הגולמיות ללא עדשה, כאשר תמונות בתוך תמונות (inset) מציגות את השוואות המיקרוסקופ של אותם חלקיקים כפי שנדרש באמצעות עדשה אובייקטיבית של 10x. השורה האמצעית מדגימה את תוצאות הפענוח הדחוס, בעוד השורה התחתונה ממחישה את תוצאות דה-קונוולוציית לואי-ריצ'רדסון. DDCS ו-DLR מתייחסים בהתאמה למרחקים ממרכז למרכז ולתמונות מיקרוסקופ, תמונות עדשה מפוענחות ב-CS, ותמונות ללא עדשה שעברו דה-קונוולוציית LR.

בשלב הבא, מוצג העיבוד הדיגיטלי של תמונות גולמיות בעלות פלואורסצנציה נמוכה דרך עדשה. אלגוריתם המבוסס על דגימה דחוסה (compressive sampling) משמש להשגת רזולוציית מרחב של פחות מ-4 µm על ידי הפרדה של זוגות חרוצים בקוטר 2 µm הצמודים זה לזה. התמונות המוכנסות מראות השוואות של עדשת מיקרוסקופ 40x, התואמות היטב לתמונות הפלואורסצנציה המפוענחות.

כאן D מתייחס למרחקים ממרכז למרכז בתמונות מיקרוסקופ. בעוד ש-DCS מתייחס למרחקים ממרכז למרכז בתמונות פחות פלואורסצנטיות שפוענחו באמצעות עדשת CS. איור זה מציג את תוצאות הדימוי ללא עדשה של תאי דם לבנים המסומנים פלואורסצנטית.

התמונות הגולמיות ללא העדשה מפוענחות במהירות באמצעות מפענח מבוסס CS, התוצאות שלו תואמות היטב לתמונה ממיקרוסקופ קונבנציונלי של אותה דגימה שצולמה עם עדשה אובייקטיבית של 10x. בנוסף לדימות במידת הצורך, ניתן לספור באופן אוטומטי את העצמים הפלואורסצנטיים המפוענחים באמצעות ממשק שפותח במיוחד ליישומי ציטומטריה על שבב. מוצג כאן ממשק לספירה אוטומטית של עצמים פלואורסצנטיים שתוכנן במיוחד ב-matlab. הדגמנו כעת את הפרוצדורה למיקרוסקופיה פלואורסצנטית ללא עדשות של תאים מסומנים ומיקרו-חרוזים על פני שדה ראייה של שמונה סנטימטרים רבוע.

פלטפורמת הדמיה השוואתית כזו, המבוססת על מפענח דחיסה מהיר. היא תהיה רב-גונית מאוד עבור ציטומטריה בתפוקה גבוהה, ניתוח מיקרו-נדיר ויישומים של מחקר בתאי חיים.