הדמיה של קולטן אסטרוגן α ב Arterioles Pial עכברוש באמצעות מיקרוסקופ דיגיטלי Immunofluorescent

המטרה הכוללת של פרוצדורה זו היא לתאר טכניקה פשוטה לאופטימיזציה של צביעה וויזואליזציה של estrogen receptor alpha באמצעות חתכים רוחביים של עורקי הקליפה שהושגו ממוחות של חולדות נקבה. הדבר משיג תחילה על ידי הסרת עורקי קליפה צבועים בצבע Evan's blue מפני שטח המוח וחיתוך שלהם לטבעות בעובי שמונה מיקרון באמצעות קריוסטט לאחר החיתוך. החתכים הרוחביים מורכבים על למסות ומודגרים עם הנוגדן הראשוני נגד estrogen receptor alpha.

בשלב הבא, מדגריים את החתכים עם הנוגדן המשני וצבע נגדי תוך שימוש בתוכנית קיבוע המכילה dpi. לבסוף, מצלמים את מקטעי כלי הדם של הקליפה המסומנים פלואורסצנטית וממירים אותם לתמונות דו-ממדיות באמצעות תוכנה למיקוד עומק מורחב (extended depth focus). בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות את קולטן האסטרוגן אלפא בעורקי הקליפה באמצעות מיקרוסקופ אימונופלואורסצנטי של Nikon עם תוכנה לעומק מורחב.

שמי ד"ר Marguerite Littleton Kearney. היום, ד"ר Neil Farani, עמית פוסט-דוקטורט במעבדה שלי, ידגים פרוצדורה פשוטה לצורך אופטימיזציה של הוויזואליזציה והצביעה של estrogen receptor alpha ב-peel.

עורקים ממוח של חולדה שעבר פרפוזיה עם צבע Evan's blue ונשמר בטמפרטורה של 70- מעלות צלזיוס. באמצעות מיקרוסקופ דיסקציה, זהו את העורקים הבולטים על פני השטח של המוח והסר אותם בעזרת פינצטה בעלת קצה דק. הסר בזהירות כל רקמת מוח דבוקה.

הניחו את העורקים בתוך מבחנה קטנה על קרח. קבעו את העורקים בפורמלידהד פודרה קרה בריכוז 2% ב-0.1 mole של PBS למשך 30 דקות. כדי להכין את העורקים לחיתוך, שפכו תוך תמיכה (embedding medium) על דיסקת הקפאה שהוצבה בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס.

הניחו מקטע של עורק בצורה שטוחה על ה-chug והמתינו לקפיאתו. לאחר שהקפיאה הושלמה באופן יציב, הניחו את העורק במצב אנכי בתוך מדיום להטמעה על דיסק ההקפאה של הקריוסטט. ודאו שקצה העורק פונה קדימה.

החזיקו את העורק באמצעות פינצטה עד שיהיה קפוא לחלוטין. הניחו את דיסקת ההקפאה עם העורק בתוך ראש הקריוסטט, ולאחר מכן חתכו טבעות עורקיות בעובי של שמונה מיקרון ישירות על עלית.

יש ליישור את טבעות העורקים באמצעות שתי מברשות צבע על השקופיות. יש לאחסן את השקופיות המוכנות בקופסת שקופיות במקרר בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה. הוצא את השקופיות מהמקרר והבאת אותן לטמפרטורת החדר על גבי משטח העבודה.

שטפו את השקופיות עם 1 עד 1.5 מיליליטר של 0.1 molar PBS. לאחר 10 דקות, רוקנו את ה-PBS וחזרו על הפעולה פעמיים נוספות. לאחר שטיפת ה-PBS האחרונה, הדגירו את השקופיות במיליליטר אחד של 50 millimolar ammonium chloride למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. כדי להפחית פלואורסצנציה אנדוגנית, שטפו את השקופיות ב-0.1 molar PBS‏ 3 פעמים, במשך 10 דקות לכל שטיפה, כפי שתואר קודם לכן. לאחר מכן, חסמו את השקופיות בתמיסת PBS המכילה 0.1% Triton X 100 בתוספת 1% normal goat serum למשך 30 דקות, כדי להפחית קישור לא ספציפי של הנוגדן הראשוני.

לאחר החסימה, דגרו את השקופיות עם הנוגדן הראשוני נגד ER alpha המדולל לריכוז של 1:500 בתמיסת החסימה למשך לילה בטמפרטורה של 4°C. הוציאו את השקופיות מהמקרר והביאו אותן לטמפרטורת החדר. שטפו נוגדנים ראשוניים שאינם קשורים באמצעות 1 עד 1.5 milliliters של 0.1%PBS שלוש פעמים למשך 10 דקות.

בכל פעם, דגרו את השקופיות עם Oregon Green, 4 88 secondary anti rabbit בתמיסת חסימה למשך שעתיים בחושך בטמפרטורת החדר; לאחר הדגירה, שטפו את השקופיות ב-0.1 molar PBS שלוש פעמים למשך 10 דקות לכל שטיפה, ולאחר מכן העבירו אותן למנדף מאוורר. הניחו טיפה של מדיום הרכבה המכיל dappy על הדגימות, ולאחר מכן הניחו זכוכית כיסוי מעל הדגימה. מרחו לק שקוף כדי לאטום את קצוות זכוכית הכיסוי והמתינו לייבוש מלא.

הנח את השקופיות המוכנות עם מקטעי כלי הדפף הצבועים תחת המיקרוסקופ וכוון את המכשיר כדי להדמיז את האזורים המעניינים המסומנים פלורסצנטית. הדמיית ה-ER alpha הצבוע היא השלב הקשה ביותר בהליך זה. מצא את מישור החיתוך של כלי הדם שבו הרצפטורים ברורים ביותר.

התחילו בהגדלה של 100 פעמים ולאחר מכן הגבירו את ההגדלה ל-600 פעמים. השתמשו במצלמה כדי ללכוד תמונות בערוצי DPI ו-ZI עבור גרעיני התאים ו-DR alpha בהתאמה, ולאחר מכן השתמשו בתוכנה כדי להמיר תצפיות מרובות של מקטעי כלי דם לתמונות דו-ממדיות (2D). כאן מוצגות תוצאות צביעה אימונופלואורסצנטית עבור ER alpha בירוק וצביעת נגד עם DPI.

בצבע כחול בטבעת עורק שבודדה ממוח של חולדה נקבה, התמונות הממוזגות מרמזות על נוכחות של רצפטור אסטרוגן אלפא גרעיני. באמצעות שילוב של תמונות Zack, ניתן להשיג תמונה ממוקדת של אימונופלואורסצנציית ER alpha; יש לבצע בקרות שליליות לאוטו-פלואורסצנציה עבור הנוגדן הראשוני והשני כאחד. שימו לב לאוטו-פלואורסצנציה המובחנת לאורך הצד האנדותליאלי של עורק שלא דגרו עם נוגדן שני.

לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בקיאים באופן בידוד וקילוף של עורקים מפני השטח של המוח, ובהכנת טבעות בחתך רוחב בעובי שמונה מיקרון. בנוסף, תכירו את השימוש בקולטן אסטרוגן אלפא המסומן פלואורסצנטית, ואת הדרכים להדמיות של הקולטנים באמצעות מיקרוסקופ אימונופלואורסצנטי דיגיטלי ותוכנת Nikon extended.