הכנת הדגימה, הדמיה, ניתוח הפרוטוקולים מיקרוסקופית סכין קצה סריקה

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להדגים את הכנת הדגימות הביולוגיות לחיתוך והדמיה תחת מיקרוסקופ סריקה בעל להב, או KESM, ואת הוויזואליזציה של נתוני מחזור התמונות שהתקבלו. דבר זה מושג תחילה על ידי קיבוע, צביעה והטמעה של הרקמה כדי להכינה להדמיה תחת ה-KESM. השלב השני של הפרוצדורה הוא הגדרת ה-KESM וביצוע החיתוך וההדמיה באמצעות תוכנת הבקרה האוטומטית.

לאחר מכן, התמונות שהתקבלו עוברות הסרת רעשים, רישום (registration) וחיתוך. השלב הסופי הוא טעינה ובחינה של מערכי הנתונים באטלס מבוסס רשת ובתוכנה להדמיה בתלת-מימד. כך ניתן להגיע לתוצאות המציגות את הארגון הנוירונלי והכלי הדם ברמה של המוח השלם, ברזולוציה של תתי-מיקרומטר.

היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות מסו ו-מזוס (Mesos) קיימות, כגון מיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת של חיתוכים סדרתיים (serial block base scanning electromicroscopy), הוא היכולת להדמות נפחים גדולים בהרבה, אם כי ברזולוציה נמוכה יותר. שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח בתחום הקונקטומיקה ומדעי המוח בכלל. היא יכולה לספק תובנות לגבי הארגון המבני של המוח, וניתן להחילה גם על מערכות איברים אחרות, כגון הריאה והכליה.

כדי להתחיל בהליך זה, מניחים את מוח העכבר המנותח בתוך צנצנת זכוכית המכילה Golgi Cox Solution. מניחים את צנצנת הזכוכית בקופסה אטומה לאור בטמפרטורת החדר למשך 10 עד 16 שבועות. שלב קיבוע נפרד אינו נחוץ, מכיוון ש-Golgi Cox solution משמש כחומר מקבע.

לאחר 10 עד 16 שבועות, שטפו את המוח במים דה-יוניזים למשך לילה בחשיכה; ביום למחרת, טבלו את המוח השטוף בתמיסת ammonium hydroxide בריכוז 5% במים דה-יוניזים למשך שבעה עד 10 ימים בחשיכה ובטמפרטורת החדר. לאחר שבעה עד 10 ימים, שטפו שוב את המוח במים דה-יוניזים בטמפרטורת החדר למשך ארבע שעות. לאחר מכן, בצעו דהידרטציה למוח באמצעות סדרה מדורגת של אתנול, תוך השארתו בכל תמיסה למשך 24 שעות: 50% ethanol ו-70% ethanol בטמפרטורה של 4°C, ו-85% ethanol.

שלושה החלפות של 95% ethanol וארבע עד חמש החלפות של 100% ethanol בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, העבירו את המוח המיובש ל-acetone ובצעו שלוש עד ארבע החלפות, כשכל אחת נמשכת יום אחד. לאחר מכן, השאירו את המוח למשך לילה במקרר בכל אחת מתערובות ה-aite-acetone הללו, ביחסים של aite ל-acetone של אחת לשתיים, אחת לאחת ושתיים לאחת.

לבסוף, העבירו את המוח ל-100%aite במקרר, ובצעו שלושה החלפות, כאשר כל אחת מהן נערכת למשך לילה. לאחר מכן, טמנו את המוח המטופל ב-100%aite וחממו ל-60 °C למשך שלושה ימים. לבסוף, רכבו את בלוק הדגימה המקובע על טבעת דגימה ממתכת, באמצעות epoxy, וגזמו את דפנות הבלוק לפי הצורך כדי להתחיל בהליך זה.

וודאו שהעכבר נמצא תחת הרדמה עמוקה ואינו מגיב ללחיצה על בהונות הרגל. לאחר מכן, בצעו פרפוזיה לעכבר דרך החדר התחתון של הלב באמצעות תמיסת פוספט בופרסלין (phosphate buffered saline) בטמפרטורת החדר, ולאחריה פאראפורמאלדה בריכוז 4% בתוך פוספט בופרסלין קר. לאחר מכן, בצעו פרפוזיה לעכבר עם תמיסה של 0.1% thi and dye במים דה-יוניים.

לאחר מכן, הניחו את הגוף במקרר בטמפרטורה של 4 °C למשך 24 שעות. לאחר 24 שעות, הוציאו את המוח מהקיבוע והניחו אותו בתמיסה רעננה של 0.1% Thionine. השאירו את המוח בטמפרטורה של 4 °C למשך שבעה ימים.

לאחר שבעה ימים, קבעו והתייבשו את המוח באמצעות סדרה מדורגת של אתנול. לאורך תקופה של שישה שבועות, השאירו את הדגימה שלושה עד חמישה ימים ב-50% ethanol, שבעה עד 10 ימים ב-70% ethanol, כשבועיים בכל אחד מ-85% ו-95% ethanol, ואת שאר הזמן ב-100% ethanol. לאחר שלושה החלפות של אצטון בטמפרטורת החדר, טמנו את המוח בפלסטיק ייעודי בתנור בטמפרטורה של 60 °C.

כדי להתחיל את הפרוצדורה לצביעת הרשת הווסקולרית באמצעות דיו הודיה, ודאו כי העכבר נמצא תחת הרדמה עמוקה על ידי בדיקה של היעדר רפלקס נסיגת האצבעות. לאחר מכן, בצעו פרפוזיה טרנס-קורדיאלית לעכבר באמצעות תמיסת סלין פוספטית (PBS) בטמפרטורת החדר, ולאחריה פורמלין ניטרלי בריכוז 10% בטמפרטורת החדר. פרפוזיה של כל הגוף בסלין ובחומר מקבע נחוצה כדי לנקות את הדם ממערכת הלב וכלי הדם ולקבע את הרקמות.

בשלב הבא, בצעו פרפוזיה לעכבר באמצעות 3.0 ccs של תמיסת פרפוזיה של דיו סיני (India ink) ללא דילול. השימוש בדיו סיני נחוץ כדי למלא באופן מלא את כלי הדם של מערכת הלב וכלי הדם. לאחר הוצאתו מהעכבר, המוח שהתקבל עובר דהידרציה באמצעות סדרה של ריכוזים מדורגים של אתיל אלכוהול ולאחר מכן מוטמע בפלסטיק ייעודי.

בעקבות הפרוטוקול שהוצג קודם לכן להכנת ה-KESM לצילום, הפעילו את המצלמה, את המאיר ואת השולחן, והעלו את הסכין ואת העדשה. לאחר מכן, התקינו את טבעת הדגימה. לבסוף, הורידו את העדשה ואת הסכין.

מדדו את ממדי הדגימה. לאחר מכן, צרו קובץ הגדרות עבור בקר השולחן של ה-KESM. ראשית, הרימו את הסכין ואת העדשה של ה-KESM לפני אתחול השולחן.

הפעילו את בקר הבמה KESM stage controller two ואתחלו את הבמה. לאחר מכן, הורידו את הסכין ואת העדשה והפעילו את המשאבה. התמקדו בעדשה ובמצלמה על ידי סיבוב כפתור המיקוד בשרשרת האופטית וכיוון שדה הראיה של המצלמה ביחס לקצה הסכין.

לחצו על "צעד אחר צעד" כדי לבחון את השלבים הראשונים של הדמיה וחיתוך. לאחר מכן לחצו על "go", כדי להתחיל את תהליך ההדמיה והחיתוך לצורך עיבוד תמונה.

הפעילו את מעבד הערימה KESM כדי להסיר ארטיפקטים של תאורה ולנרמל את עוצמת הרקע בכל התמונות. חזרו על הפעולה עבור כל תיקיות המשנה של הנתונים. כדי להציג את הנתונים באמצעות אטלס המוח KESM, עברו לאתר זה ובחרו באטלס המתאים כדי לעבור לעומק שונה.

בחרו מהתפריט הנפתח את העומק הרצוי בכל שלב, ולאחר מכן לחצו על סימן הפלוס (+) כדי להגדיל או על סימן המינוס (-) כדי להקטין את עומק ה-Z. אפשרויות נוספות כוללות הגדלה (zoom in) או ניווט באמצעות אטלס המוח KESM. השתמשו בתפריט הנפתח כדי לכוון את מספר השכבות ואת מרווח השכבות לצורך ויזואליזציה של נתונים באמצעות VIS lab.

הפעילו את האפליקציה וצרו פרויקט חדש. הפרויקט צריך לכלול את ההגדרות compose 3D from 2D files, set world matrix arithmetic one ו-view 3D connected. לפי סדר זה, יש להגדיר את הפרמטרים המתאימים כפי שמוצג ב-view 3D תוך לחיצה על המקש הימני של העכבר.

הזיזו את העכבר כדי לכוון את אזורי הסף שניתן לחתוך. האוריינטציה השתנתה, התאורה השתנתה, או שהרקע הופעל או כובה. תוצאות KESM מייצגות מודגמות על ידי סרטוני הווידאו הבאים; המוצגים ראשונים הם הדמיות נפח של KESM, מחסניות נתונים של דיו סינית (India ink) של מוח שלם עבור מערך הנתונים הווסקולרי, החל מתצפית מקרוב של הנתונים הווסקולריים ברוחב של כ-100 microns.

סרטון זה של KESM, המציג נתוני דיו סינית של מוח שלם, מראה שלושה מבטים סטנדרטיים של מערכת כלי הדם במוח של עכבר, שנדגמו מנתונים ברזולוציה גבוהה עם רוחב של כ-10 מילימטרים. המבט הסגיטלי, המבט הקורונלי והמבט ההוריזונטלי, כמו גם מעבר (fly through) בחתך הקורונלי. נתוני גולג'י של מוח עכבר שלם ב-KESM מומחשים בסרטון זה, המראה מעבר לאורך שלושת מישורי החיתוך השונים, החל ממבט הבלוק, ולאחריו המבט הסגיטלי, המבט הקורונלי והמבט ההוריזונטלי.

להלן פרטים נוספים של נתוני GoGy של מוח עכבר שלם ב-KESM. סרטון וידאו ראשון זה מציג את המוח הקטן ואת תאי פורינז'ה. סרטון שני זה מציג את קליפת המוח ואת תאי הפאראמטאל.

לבסוף, KESM. נתוני nle של המוח השלם מוצגים בשני סרטוני וידאו אלו. תחילה מוצג תקריב של נתוני ה-NLE.

סרטון זה מציג שלוש תצפיות סטנדרטיות של נתוני Nle של מוח עכבר שלם, אשר נדגמו מנתונים ברזולוציה גבוהה. מוצג גם חתך רוחבי למשם תצפית ברורה על המבנים הפנימיים לאחר פיתוח זה. טכניקה זו סללה את הדרך עבור חוקרים בתחום מדעי העצבים לחקור רשתות נוירונליות וכלי דם במוח העכבר.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של הכנת דגימות, דימות וניתוח נתונים עבור מיקרוסקופ סריקה בעל קצה סכין (knife edge scanning microscope).