וידאו קצב סריקה מיקרוסקופית Confocal ו Microendoscopy

סרטון זה מדגים כיצד להרכיב מיקרוסקופ קונפוקאלי עם סריקה בקצב וידאו באמצעות רכיבים סטנדרטיים הנרכשים מהמדף. מיקרוסקופ קונפוקאלי סורק מסתמך על תנועה מתואמת של שתי מראות סריקה כדי להזיז את הקרן על פני מישור הסריקה (raster plane); אור מהמראה הראשונה נסרק אופקית דרך הסט הראשון של עדשות ממסר (relay lenses), הממקמות אותו חזרה לנקודה נייחית על המראה הסורקת השנייה. אותה תנועת סריקה מועברת לאחר מכן דרך עדשות הסריקה והצינור, ובכך ממוקמת קרן האור המורחבת כעת על המפתח האחורי של עדשת היעד.

המראה השנייה, שתנועתה איטית בהשוואה למראה הראשונה, סורקת בו-זמנית את ציר ה-Y, מה שמאפשר פעולת סריקה מעל ומתחת למישור המוצג ויוצר רשת מלבנית על פני השטח של הדגימה. היתרון המרכזי של פרוטוקול זה על פני רכישת מיקרוסקופ זמין מסחרית הוא העלות הנמוכה והיכולת להתאים את המכשיר לצרכים הספציפיים של פרויקט דימוי. בעת עבודה עם כל לייזר, חיוני לנקוט באמצעי בטיחות מתאימים כדי למנוע פגיעה בעין.

הקפידו להרכיב משקפי מגן מתאימים ללייזר בכל פעם שהדבר אפשרי. צופים ו/או חוקרים שאינם עוסקים באופן פעיל בכיול או בעבודה עם קרן הלייזר חייבים להרכיב משקפיים בכל עת. הסירו שעוני יד או תכשיטים מבריקים ומחזירי אור.

חשוב מכל, ודאו שאתם עוקבים אחר הקרן ושולטים בה בכל עת על ידי עצירת מסלולה באמצעות חוסם קרן או כרטיס ביקור מותקן. הדבר חשוב במיוחד בעת יישור מראות, שכן מסלול הקרן עלול להיות קשה לחיזוי. כמו כן, לעולם אל תניחו את עיניכם בגובה מסלול הקרן.

כבה את הלייזר אם עליך לחצות את מישור הקרן לפני הרכבת המיקרוסקופ. ודא שכל הציוד הדרוש להבנייה זמין, כולל לוח הבסיס האופטי (optical breadboard) ותומכי 90 מעלות, כל המראות, העדשות והפילטר הדיכרוי, יחד עם התפסים ואמצעי הקיבוע המתאימים, הן מראות הסריקה והן גלאי הפוטוים. מומלץ להחזיק בהישג יד גם מחולל פונקציות כדי לבחון את פעולת הסריקה ולשלוט במראות במהלך הכיול.

מומלץ מאוד להבריג את לוח המעגלים (breadboard) למשטח העבודה כדי להבטיח יציבות. התחילו בהרכבת המיקרוסקופ על ידי הצבת סיב האופטי מסוג pigtail במתקן האופטי, והנחת מכלול זה במרכז לוח המעגלים האופטי. מיקום זה תואם למקור של הקרן הכחולה, כפי שמוצג כאן.

הדליקו את מקור האור. השתמשו בברגי הכיוון כדי לכוון באופן גס את קרן האור כך שתנוע בקו ישר הן באופן אופקי והן באופן אנכי. מקמו צמצם (iris) לפני קולטור הסיב האופטי.

בשלב הבא, כווננו את גובה הצמצם כך שהקרן תעבור דרך המרכז. לאחר מכן, הרחיקו את הצמצם מה-ator לאורך נתיב הקרן. בדקו את יישור הקרן.

השתמש בשני ברגי הכיוון כדי למקם מחדש את הקרן על הצמצם במידת הצורך. הנח את מראת ה-diic המותקנת בנתיב הקרן, כך שקרן הלייזר תמוקם במרכז המראה. סובב את תומך המראה כדי להחזיר את הקרן בזווית של כ-90 מעלות, תוך וידוא שגובה הקרן אינו משתנה.

הדק את המראה לשולחן על ידי הידוק הבורגים במתקן. לאחר מכן, מקם את מראת הגלוונומטר התהודה המותקנת בנתיב קרן הלייזר. יש להקפיד שקרן הלייזר ממוקמת בדיוק במרכז האופקי של פני המראה.

סובב את תושבת המראה כך שתשקף את קרן הלייזר בזווית של 90 מעלות. לאחר מכן, כוון באופן גס את ההשתקפות מהמראה כדי לשמור על אותו גובה אנכי של קרן הלייזר. כעת, קח שני צמצמים (irises) והצב אותם ישירות מול ה-resonant gal.

לאחר מכן, באמצעות קרן הלייזר המוחזרת ממראת הגלוואנומרזוננטית (resonant gal mirror) כנקודת ייחוס, קבעו את גובהן האנכי כפי שנעשה קודם לכן. כעת, תוך שימוש בחורי הברגים בלוח האופטי (optical breadboard) כמדריך חזותי, הצמידו את שני הצמצמים (irises) בקו ישר. כווןו את המראה הראשונה בנתיב, שהיא המראה הדיכרואית, כדי למרכז את הקרן בצמצם הראשון.

לאחר מכן, כווננו את המראה השנייה בנתיב. השתמשו ב-gal התהודה כדי למרכז את הקרן על הצמצם השני. כווננו את שתי המראות הללו באופן איטרטיבי עד שהקרן תהיה מיושרת דרך שני הצמצמים.

יש לוודא שקרן הלייזר המוחזרת ממראת הגלבנומטר (gal mirror) המהודדת עדיין מוחזרת ממרכז המראה בקירוב. אם הקרן סוטה, יש לכוונן את תושבת קולטור הסיב (fiber collator) ולחזור על הכיונונים כאשר הקרן ממורכזת בשני הצמצמים הפתוחים. השלב הבא הוא מיקום שתי עדשות השליחה (relay lenses), אשר יעבירו את הדמות מהמישור הטלצנטרי הסטטי הראשון אל המישור הטלצנטרי הסטטי השני.

עבור מיקרוסקופ זה, לעדשות הנבחרות בריליי הראשון יש את אותו אורך מוקד F, ולכן המרחק בין שתי המראות כאן הוא פשוט ארבעה F. עבור הגדרה זו, F שווה ל-90 מילימטרים, כך שמיקום ה-four F יהיה במרחק של 360 מילימטרים מהמראה הסורקת. כדי להבטיח שהעדשות ממרכזות בדיוק במסלול הקרן, הניחו את העדשה הראשונה במסלול הקרן והביטו בנקודת קרן הלייזר באיריס הבא במסלול הקרן. לאחר הנחת העדשה, כווןו את גובה העדשה כך שהמרכז האנכי של הקרן יהיה במרכז האיריס.

בשלב הבא, כווננו את מיקום הקרן האופקית כדי למרכז את הקרן על הצמצם (iris). חזרו על תהליך זה עם העדשה השנייה. לאחר מכן, תבוצע הגדרה של מראת הסריקה והמיקרוסקופ יסובב כדי לאפשר הצבה ויישור פשוטים של חלקים שדורשים בדרך כלל כיוון אנכי.

כדי למצוא את המיקום המדויק של המישור הטלצנטרי השני, חברו את ה-resonant gal O ליחידת הסריקה שלו והפעילו אותה. השתמשו בכרטיס ביקור כדי לעקוב אחר נתיב קרן הסריקה דרך שתי העדשות. המישור הטלצנטרי השני ימוקם במרחק של בערך ארבעה F מה-resident gal O, וניתן לזהותו כמיקום שבו קרן הסריקה נראית נייחת.

סמנו את לוח הבד (breadboard) מתחת למיקום זה בעזרת עיפרון. לאחר זיהוי מישור ה-telecentric, הגדירו את כניסת מראת הסריקה ל-0 volts והפעילו את חומרת בקרת המראה כך שהמראה תתייצב בעמדתה הניטרלית. לאחר מכן, מקמו את מראת ה-galil לסריקה סטנדרטית במיקומו המדויק של מישור ה-tele.

כוון את מיקום המראה כך שהקרן במישור הטלה תפגע בדיוק במרכז מראת הסריקה, והדק את תושבת המראה. כעת שחרר את בורג הנעילה המחזיק את מראת ה-gal וסובב אותה, תוך וידוא שהקרן מתפשטת בצורה אנכית. כעת כבה את הלייזר ואת אלקטרוניקת הסריקה.

נתק את הסיב ונתק את מראות הסריקה. לאחר מכן, באמצעות תושבות קיבוע של 90 מעלות ללוח לחם (breadboard), חבר את לוח הלחם השני לראשון.

לבסוף, סובב בזהירות את המיקרוסקופ כולו כך שלוח הבסיס (breadboard) החדש יונח בצורה שטוחה, והשתמש בתפס כדי לקבע את המיקרוסקופ במקומו. חבר מחדש את ה-gal o ואת הלייזר, וזכור להחזיר את ה-gal O לאפס וולט. ניתן לבצע את שאר שלבי ההקמה, שהיו קודם לכן במצב אנכי, בקלות על גבי לוח הבסיס השטוח.

בשלב הבא, נגדיר את סט עדשות השליח השני, המכונה רשמית עדשת הסריקה (scan lens) ועדשת השפופרת (tube lens). אנא עיינו בפרוטוקול הכתוב המצורף לקבלת מידע חשוב מאוד על בחירת השילוב הנכון של עדשות. התחילו בהצבת העדשות.

ראשית, סדרו את המראות הדרושות להכוונת קרן הלייזר לעדשת היעד. מקמו את המראה הגדולה הראשונה, בגודל שני אינצ', קרוב לקצה לוח העבודה (breadboard) וסובבו את תושבת המראה כדי להחזיר את קרן הלייזר בזווית של כ-90 מעלות. כווננו את ההחזרה מהמראה כדי לשמור על אותו גובה אנכי של הקרן.

לאחר מכן, מקם את המראה השנייה בגודל שני אינצ' בקצה המנוגד של לוח הבסיס (breadboard) כדי להכווין את הקרן בזווית של 90 מעלות, והשתמש בברגי הכוונון כדי לקבע אותה במקומה. לאחר מכן, הגדר שני דיאפרגמות (irises) וכוון את שתי המראות כפי שנעשה קודם לכן כדי למרכז את הקרן. לבסוף, מקם את עדשת הסריקה במרחק השווה לאורך המוקד שלה מהגלוון (gal) בנתיב הקרן, וכוון את מיקומה האופקי והאנכי.

כדי למרכז את נקודת הלייזר על הצמצם הראשון בין שתי המראות. מקמו בזהירות את עדשת הצינור הגדולה בגודל שני אינץ' במרחק המתאים מעדשת הסריקה, וכווןו את מיקומה האופקי והאנכי כדי למרכז את הקרן על הצמצם הראשון. במערך זה, עדשת הצינור ממוקמת במרחק של 75 millimeters פלוס 300 millimeters כאשר כל הרכיבים נמצאים במקומם.

חברו את gal O ליציאה של מחולל פונקציות חשמלי סטנדרטי או למעגל בקרה, והגדירו את המתחים משיא לשיא לבין וולט אחד לשלושה וולט. לאחר מכן, התחילו לסרוק את שתי המראות באמצעות כרטיס ביקור. אתרו את קרן הלייזר במישור הניצב, 300 millimeters אחרי עדשת הצינור.

מקמו את העדשה האובייקטיבית במסלול הקרן, תוך הקפדה על מיקום המפתח האחורי של העדשה האובייקטיבית קרוב ככל האפשר למישור הניצב. הגדירו את במת הדגימה, וודאו שתושבת ציר Z הניתנת להזזה אינה פוגעת בתושבת העדשה האובייקטיבית בעת הזזתה לאורך טווח התנועה שלה. כדי להגדיר את המערכת הקונפוקלית, את חור הפין (pinhole) ואת הגלאי, התחילו בניתוק כל ספקי הכוח והסיבים האופטיים.

סובב את מכלול המיקרוסקופ כך שיישען שוב על לוח הלחם (breadboard), כשהוא מחזיק את מראת הסריקה התהודית. לאחר חיבור מחדש של הסיב לקולמטור ולמראת הסריקה הסטנדרטית, ולחיבור כבלי ההספקה והבקרה, הגדר אפס וולטים במתח הבקרה המפעיל את הגלוונומטר (gal) של הסריקה הסטנדרטית כפי שנעשה קודם לכן על הבמה, והנח דגימה של צבע בהיר כלוא בין שתי זכוכיות כיסוי. לאחר מכן, הדלק את מקור הלייזר והבאת את הצבע למיקוד.

כווננו את עוצמת הלייזר כדי להשיג פלואורסצנציה בהירה ככל האפשר באמצעות כרטיס ביקור. עקבו אחר פליטת הפלואורסצנציה מהדגימה דרך עדשת העדפה, דרך מערכת הסריקה, אל המראה הדיכרואית, המשקפת את קרן הלייזר ותעביר את פליטת הפלואורסצנציה. אתרו אות פלואורסצנציה זה בצד השני של המראה הדיכרואית.

כעת העמידו את תאורת החדר על עוצמה נמוכה. הניחו מראה מאחורי המראה הדיכרואית כדי להחזיר את הפליטה בזווית של 90 מעלות. לאחר מכן, באמצעות צמצם (iris) עם מראה, כוון את קרן הפלואורסצנציה כך שתהיה ישרה ומקבילה ככל האפשר ללוח העבודה (breadboard).

בשלב הבא, יוקם יחידת חור הפינולה (pinhole) הקונפוקלית באמצעות מכלול תושבת כלוב למסנן מרחבי מבית Thor Labs. דיאגרמה זו מפרטת את ההקמה. מראת הסריקה ממוקמת במישורים נייחים הנמצאים במיקום טלסקופי (tele) ביחס לעדשה אובייקטיבית נייחת.

זוגות עדשות במישור המפתח האחורי בין המישורים הנייחים משמשים להעברת הקרניות הסרוקות. לזוג העדשות הראשון יש אורך מוקד שווה, המהווה טלסקופ ביחס של 1:1. הזוג השני של העדשות, המכונה באופן רשמי עדשת הסריקה ועדשת השפופרת, אינן חייבות להיות בעלות אורך מוקד שווה ולעתים קרובות משמשות כטלסקופ להרחבת הקרן על מנת להבטיח מילוי יתר של המפתח האחורי של העדשה.

אור שנפלט מהדגימה חוזר דרך מערכת הסריקה ועובר דרך המראה הדיכרואית. עדשת מיקוד קצרה או עדשה אובייקטיבית ממקדות את אור הפליטה דרך חור הפינהול הקונפוקאלי, אשר נאסף לאחר מכן על ידי עדשה. עדשה סופית ממקדת את פליטת האור המסוננת והקונפוקאלית על שפופרת מכפיל פוטו-אלקטרונים (PMT).

מקמו את יחידת המסנן המרחבי בקו עם נתיב קרן הפליטה, תוך הקפדה למרכז את תושבת עדשת המיקוד הראשונה על קרן הפליטה. במקרה זה, נבחרה יחידת מסנן מרחבי עם חור סיכה (pinhole) בגודל 100 microns. לאחר מכן, התקינו עדשה בעלת אורך מוקד קצר ביחידה והזיזו את תושבת התרגום בציר Z עד שניתן יהיה להבחין במיקוד ברור על פני השטח של חור הסיכה.

ודאו כי היחידה כולה מונחת לאורך הקו הישר שנקבע על ידי קרן הפלואורסצנציה. הדקו את היחידה ללוח הבסיס (breadboard). כעת, באמצעות כפתורי הכיוונון של במת ההזזה (translation stage), כווננו את שני הצירים כדי לבצע חיפוש דו-ממדי על פני משטח תושבת הפינוהול (pinhole mount), במטרה למצוא את הנקודה שבה אות הפלואורסצנציה העובר דרך הפינוהול הוא מקסימלי.

בשלב הבא, מקם את עדשת הציפוי על תושבת הכלוב לאחר הפינהול. באמצעות כרטיס ביקור, אתר את האיון הפלואורסצנטי העובר דרך היחידה הקונפוקליתית, והזז את עדשת הציפוי לאורך המוטים עד שהפלואורסצנציה הנפלטת תהיה מרוכזת ככל האפשר. הגדר את מכלול שפופרת הכפלת הפוטונים (PMT). מקם עדשה בעלת אורך מוקד של 50 millimeter במסלול קרן הפליטה הפלואורסצנטית ואתר את נקודת המוקד שלה.

סמנו נקודה זו על לוח הבדיקה (breadboard). כעת כבו את הלייזר לחלוטין ומקמו את שפופרת מכפיל הפוטונים (photo multiplier tube) כך שחלונה תהיה קרובה ככל האפשר לנקודת המוקד המסומנת. לאחר מכן, בעזרת מחוללי עדשות מתכווננים, חברו את המכלול לעדשת המיקוד.

עטפו בסרט דביק כהה את כל נתיבי הקרן החשופים לאחר ה-pinhole, והדליקו את הלייזר תוך שמירה על עוצמה נמוכה ביותר. הדליקו את שפופרת הפוטומולטיפליקטור (photomultiplier tube) תוך קריאה זהירה של המתח באוסצילוסקופ. ככל שעוצמת הלייזר עולה, הגבירו את המתח עד שניתן יהיה לראות במסך האוסצילוסקופ קריאה דמוית פיק (spike) ו/או היסט (offset) של זרם ישר (DC).

וודאו כי אות זה אכן נובע מהפלוורסנציה על ידי כיבוי הספק הלייזר או חסימת נתיב הקרן כדי לצפות באובדן האות. לבסוף, בצעו כיוון חוזר של הפינהול (pinhole) להשגת אות מקסימלי באוסצילוסקופ. לאחר מניפולציה ראשונית של מיקום ציר Z של עדשת המיקוד ולאחר מכן התאמה של במת התרגום YZ, הגדרת החומרה של מיקרוסקופ קצב הווידאו הושלמה.

ראשית, כבה את שפופרת הכפילת הפוטונים. כעת חבר את לוחות הבקרה המותאמים אישית של המראות ואת המחשב כפי שמופיע בתרשים בפרוטוקול הכתוב המצורף. ניתן להתאים מערכת זו לביצוע מיקרו-אנדוסקופיה סורקת קונפוקלית.

החלף את הבמה בבמה להחזקת סיב, פרטים נוספים מופיעים בטקסט הנלווה. המיקרוסקופ הקונפוקאלי הסורק הזקוף והמיקרו-אנדוסקופ המוכנים צריכים להיראות כפי שמוצג כאן. קרני הלייזר והפליטה שורטטו כהנחיה חזותית.

במהלך פעולת מיקרו-אנדוסקופיה, תושבת סיבים מחזיקה את סיב הדימוי במקומו לצורך הניסויים. ניתן להחליף בקלות תושבת סיבים זו בבמה מסוג XY לשימושים שונים. פלטפורמת מיקרוסקופ אנכי המוצגת כאן היא תמונת בדיקה מייצגת של האות M (באותיות קטנות) המודפסת על כרטיס ביקור לבן, שצולמה באמצעות כרטיס לכידת פריימים בקצב וידאו כדי להפיק תמונות מהאות המגיע. Bleached.

נייר לבן מכיל פלואורופורים שניתן לעוררם בקלות באמצעות אור UV ואור כחול, מה שגורם לרקע בהיר מאחורי האותיות הכהות. נבחר מסנן פליטה המרכזו ב-515 nanometers כדי לאסוף פליטה פלואורסצנטית זו. ניתן להבחין בעיוות קל של התמונה, במיוחד ליד השוליים הצידיים של מסגרת התמונה.

עיוות זה נובע מדפוס הסריקה הסינוסואידלי של מראת ה-gvo בתדר של שמונה קילו-הרץ ונדון בפירוט במסמך הנלווה. סרטון זה מציג נתוני קצב וידאו לדוגמה שהתקבלו מסריקה של כרטיס ביקור. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה כיצד לבנות ולהתאים מיקרוסקופ סריקה קונפוקאלי בקצב וידאו.

יש לזכור כי עבודה עם אור לייזר עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות בעת ביצוע הליך זה, כגון הסרת כל תכשירי המתכת המחזירים אור והימנעות מעבודה כאשר העיניים נמצאות בקו גובה של קרן הלייזר.