בניית מערכת בתקציב נמוך לייזר Axotomy לחקר התחדשות אקסון ב ג elegans

המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים כיצד להרכיב וליישר מערכת של אבלציה בלייזר למחקר של התחדשות אקסונים ב-CL gans. דבר זה מושג תחילה על ידי התקנת פתח לייזר, polarizer של תומפסון, לוח חצי-גל, מראה סיבוב, פריסקופ, מסילה ומראת מסילה על לוח ניסויים (breadboard). השלב הבא של ההליך הוא יישור קרן הלייזר אל הקרן היוצאת מעדשת המעבה של המיקרוסקופ.

לאחר מכן, מותקנת עדשת מרחיב קרן הלייזר, ומכווננת וממוקמת כך שקרן הלייזר תהיה במרכז וללא התבדרות. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא להוביל את נקודת אבלציית הלייזר להיות תואמת למיקוד התמונה באמצעות ביצוע כיוונונים עדינים. בסופו של דבר, ניתן לחתוך בדיוק אקסונים של חצי מיקרון עם נזק מינימלי לרקמה סביבית באמצעות קרן לייזר מוגבלת דיפרקציה, גם כאשר יישור ה-XY NC אינו מושלם.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון לייזרים בפסייקטורה של פמטו-שנייה, הוא עלותה הנמוכה יחסית, העומדת על 15,000. היא דורשת תחזוקה מינימלית ומספקת חיתוך מדויק מאוד של אקסונים. למרות ששיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי התחדשות אקסונים ב-C. elegans, ניתן להחילה גם על מערכות אחרות כגון זבובים, דגי זברה, עכברים, מערכת העצבים ההיקפית ותאי in vitro.

בעיקרה, כל תא הנמצא במרחק של 30 עד 50 מיקרומטרים מהפנימי. התחילו עם הרכיבים הממוקמים על לוח הבסיס (breadboard) והדקו את מוט הפריסקופ של הלייזר ואת תמכי המסילה המוגבהים. מערכת זו משתמשת בלייזר מסוג Class 3B שעלול לגרום לנזק קל לעיניכם, לכן אנא הקפידו על כללי הבטיחות בעבודה עם לייזר.

התייעץ עם מישהו במחלקה לפיזיקה במוסדך לגבי העבודה הבטוחה עם לייזרים בעלי קרן פתוחה. במהלך תהליך הכיוון, הגדר תמיד את הלייזר להספק הנמוך ביותר. כאשר אתה מביט דרך העיניות, ודא שהלייזר חסום באופן מכני ושהוא כבוי.

כעת, מקמו את המיקרוסקופ; ראשית, יישרו אותו עם ציר המסילה. שנית, יישרו אותו עם קרן האור המועברת מעשת המקרינה של המיקרוסקופ. שלישית, יישרו את שני קצות המסילה לקרן המקרינה באמצעות צמצם או עדשה מתכווננים המחוברים למסילה.

השתמשו בפלס ובמגבי מעבדה כדי לכוון את גובה המסילה לפני ההמשך. ודאו ששני קצות המסילה מיושרים. כעת, ודאו שקרן הלייזר עוברת דרך ה-gland, המקטב של Thompson והלוחית החצית, ושאינה פוגעת בקצותיהם בעת הסיבוב.

הפילטר החצי-חשאי (halfway plate) יכוון את הספק הלייזר כאשר כל הרכיבים מקובעים ללוח הבסיס (breadboard). הפעילו את הלייזר, קבעו את תדירות הפולסים למצב רציף של 100 והפחיתו את ההספק למינימום באמצעות הפילטר החצי-חשאי. השתמשו במדבקת פוסט-איט או בנייר עדשות כדי להבחין בקרן הלייזר.

כעת נעלה את קרן הלייזר מהלוח המגנטי (breadboard). התאימו וקבעו את המראות המותקנות על תושבות קינמטיות לפי הסדר, מהלייזר והלאה, כדי להוביל את הקרן אל המראה המותקנת בקצה המסילה המוגבהת. בסיום הפעולה, קרן הלייזר צריכה להיות מיושרת בקירוב למרכז המראות, והמראות צריכות להיות מכוונות בזווית של כ-45 מעלות לציר קרן הלייזר, לפני יישור קרן הלייזר עם קרן האור המועברת של המיקרוסקופ.

הסירה או פתח את כל מסנני ה-ND והמחיצות במודול הביניים. כעת נתחיל בשלב הקריטי ביותר להשגת חיתוך מדויק של אקסונים ללא נזק סביבתי מוגבר. נכוון את הלייזר בדיוק בצירים x, y ו-Z בהספק הלייזר הנמוך ביותר כדי להשיג את נקודת האבלציה הקטנה ביותר.

ניתן לראות את הלייזר ואת קרני האור המועברות בו-זמנית כנגד דף נייר. לשם התחלה, מקמו את הנייר בקרבת פתח המיקרוסקופ. כעת התחילו בכיול הלייזר באמצעות כוונוני הגס של המראה בחלקו העליון של הפריסקופ והמראה בקצה המסילה.

הניחו דף נייר בין עדשת המקרין (condenser) המיושרת לבין תוף העדשות הפתוח. המשיכו להשתמש בכיוונונים העדינים של מראת המסילה כדי ליישר את קרן הלייזר למרכז אלומת האור המועברת הגדולה יותר. כעת, קבעו את המיקרוסקופ במקומו באמצעות תפסנים.

שלבים נוספים להערכת יישור הלייזר ניתן למצוא בכתב היד המודפס. יש להתקין מרחיבי קרן גלילאיים כפולים כדי להרחיב את קרן הלייזר בעלת עובי 300 micron פי 33, כך שתמלא את המפתח האחורי של העדשה באורך 10 millimeter. התחילו בהרכבת ארבע העדשות על גבי נשאי העדשות.

לאחר מכן, הצמידו את העדשות למסילה כך שכולן יהיו על אותו ציר אופטי ומקבילות בדיוק למסלולו של קרן הלייזר. הפעילו את הלייזר וכוון אותו להספק מינימלי ולמצב רציף. בצעו כיוון גס של יישור הקרן דרך כל אחת מהעדשות.

השתמשו בנייר כדי לראות את הקרן. כעת כבו את הלייזר. התקינו תריס בטיחות על הלייזר והסירו את המיקרוסקופ מנתיב קרן הלייזר.

הדליקו שוב את הלייזר והשקיפו עליו כנגד קיר סמוך. השתמשו בכיוונון העדין של העדשות כדי להרחיב את קרן הלייזר. לאחר מכן, כוונו את שתי המראות האחרונות המורכבות על תושבות קינמטיות כדי ליישר את הקרן לצורה של עיגול בעוצמה אחידה במיקומה המשוער של המפתח האחורי של העדשה.

בחנו את הגודל והאחידות של קרן הלייזר על גבי נייר. לאחר מכן, כווןו את הקרן להתכנסות אפס (zero convergence) על ידי התבוננות באופן שבו גודל הקרן משתנה כאשר מזיזים את הנייר הרחק מהעדשה. כבו את הלייזר והפעילו את התריס המכני.

החליקו את המיקרוסקופ חזרה למסלול קרן הלייזר תוך שימוש במהבקי הקיבוע כדי להגדיר את היישור הנכון. החזירו את המהבקים לצד החופשי של המיקרוסקופ, אך אל תהדקו אותם. כעת הפעילו את הלייזר.

הסר את תריס הבטיחות וסובב את תותריך העדשות למצב פתוח תוך שימוש בנייר על הבמה; קרן לייזר מורחבת ואחידה הממורכזת עם קרן האור המועברת מהקונדנסור צריכה להיות גלויה. אם הקרניים אינן ממורכזות, מרכז אותן על ידי שחרור תפסני המיקרוסקופ והזזתו בזהירות. כעת, סגור את תריס הבטיחות והגדר את הלייזר למצב טריגר (trigger mode).

סובב את העדשה בעלת ההגדלה 60 למקומה. כעת דגם את השריטות על פני השטח של שקף המטרה. הסר את תריס הבטיחות, הפעל את לייזר האבליציה וכוון את הספק של הלייזר כדי להגיע לנקודת אבליציה מינימלית.

הנקודה צריכה להיות מעגלית ובמרחק של חמישה עד 10 מיקרון ממרכז התמונה, מרכז נקודת האבלאציה. באמצעות הכוון העדין של מראת המסילה המורכבת באופן קינמטי, כדי לשמור על הנקודה ממוקדת ועל פרופיל קרן אחיד, יהיה צורך לבצע כיוון חזרתי של מראת המסילה ומראת הפריסקופ העליונה. העריכו את מיקוד ה-Z של הלייזר על ידי הזזת המיקוד למעלה ולמטה באופן שיטתי בצעדים של מיקרון אחד, תוך הפעלת לייזר האבלאציה בכל שלב.

אם הקרן הורחבה וכוונתה כראוי ועם התכנסות מכוונת כהלכה, היא אמורה לבצע אבלציה מקסימלית במיקוד התמונה, ואבלציה חלשה או ללא אבלציה כלל, מיקרון אחד מעל או מתחת למיקוד. אם נקודת האבלציה המקסימלית נמצאת מעל או מתחת למיקוד התמונה, יש לבצע את הכיוונונים הסופיים של מיקוד ה-Z של הקרן המורחבת על ידי הזזת עדשה L 3 של הטלסקופ הגלילאי עד אשר אבלציית הלייזר תהיה תואמת למיקוד התמונה. נמטודות הותקנו על סלייד מותאם אישית ואקסונים נבלו באמצעות המערכת שנבנתה, Laser exo somy, והדמיית time-lapse של התחדשות האקסונים הייתה חסונה מאוד.

באמצעות במה ממוטרת, ניתן היה לחתוך ולדגם באופן שגרתי ומדויק חמישה אקסונים בחמישה בעלי חיים שונים, על גבי שريחה אחת. זמן הדמיות האקסונים היה הגורם המגביל.

כ-10% מהניסויים הניבו סרטי time-lapse באיכות גבוהה. שאר הניסויים סיפקו נתונים טובים, אך היו פחות מושכים מבחינה אסתטית בשל תנועות רעידה קטנות של התולעת, שהחלו בדרך כלל לאחר חמש עד שמונה שעות של קיבוע. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב תמיד להעריך במדויק את יישור הלייזר בצירים x, y ו-Z.

הבעיה הנפוצה ביותר שבה נתקלים בניסיון לחתוך אקסון היא נזק גשמי (collateral damage) או חוסר יכולת מוחלט לחתוך את האקסונים, ודבר זה נובע כמעט תמיד מלייזר שאינו מיושר כראוי. מערכת אבלציה בלייזר זו וטכניקה זו להדמיית התחדשות אקסונים ב-c Agains יאפשרו לכם לבחון באופן שגרתי את ההשפעה של כל מוטציה גנטית על התחדשות האקסון. NCL Agains.