בניית Hydrogel קולגן עבור משלוח של התא טעון גזע Chitosan microspheres

פרוטוקול זה מציע אסטרטגיה in vitro להעברת תאי גזע ממיקרוספירות קיטוזאן לתוך פיגום של ג'ל קולגן, לקצירם ולתרבותם. תאי הגזע האדיפוציטיים הראשוניים עוברים תחילה אמולסיה ושחזור של תכשיר מיקרוספירות קיטוזאן. לאחר מכן, זורעים את תאי הגזע על מיקרוספירות הקיטוזאן ומגדלים אותם בתוך תבנית תרבית עם מעטפת ממברנה בעלת גודל נקבים של שמונה מיקרון כדי להפיק CSM טעון ב-CS, ובסוף מערבבים את מערכת ההעברה של המיקרוספירות עם פיגום תלת-ממדי של ג'ל קולגן.

בסופו של דבר, מערכת CSM זו מציעה פוטנציאל לשימוש ברפואה רגנרטיבית ובמסירת תרופות. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון הזרקת תאים או מיקרו-אנקפסולציה, הוא יכולתם של התאים להיקשר לחומר נשא ולהישמר לאחר היישום הראשוני. באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו יתקשו בביצועה, כיוון שלמיקרוספירות esan יש מטען סטטי אינהרנטי.

טעינת תאים על מצע של מיקרוספירות תהיה מאתגרת ללא הפרעה לתאים. יש להוציא ולשטוף רקמת שומן פרינאלית ואפידרמלית מעכבר, לקצץ את הרקמה, ולאחר מכן להעביר גרם אחד עד שני גרמים ל-25 milliliters של HBSS המכיל 1%FBS. לאחר צנטריפוגציה, יש לאסוף את שכבת רקמת השומן הצפה לתוך בקבוק ארלנמאייר של 125 milliliter.

הוסף 25 milliliters של collagenase type two והדגר את התגובה על מנער אורביטלי. כעת, הסר בזהירות את פלקציית הנוזל שמתחת לשכבת השמן והשומן וסנן באופן רציף דרך מסנני רשת ניילון של 170 microns. אסוף את התאים על ידי סבוב (centrifugation) לאחר שני שטיפות עם 25 milliliters.

החייאה ב-HBSS, השעה את המשקע ב-30 milliliters של מצע גידול mesen pro מועשר. פצל את התאי הגזע המבודדים מרקמת שומן לשני מבקורי תרבית T 75 והעלה את ריכוז ה-A SC באינקובטור לח עם 5%carbon dioxide בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. פרוטוקול CSM זה הוא תהליך של אמולסיית מים בשמן המשתמש בטכניקת coer יונית.

בצעו אמולסיה של 6 milliliters של תמיסה מימית של chitosan בתוך 100 milliliters של תערובת פאזה שומנית באמצעות ערבוב מכני (overhead) ומגנטי בו-זמנית בכיוונים מנוגדים למשך שעה עד לקבלת אמולסיית מים ושמן יציבה; הוסיפו 1.5 milliliters של 1% potassium hydroxide ב-n octal בכל 15 דקות למשך ארבע שעות. עם השלמת תגובת הצמירה היונית (ionic cross-linking), שפכו בזהירות את הפאזה השומנית והעבירו מיד את הכדורים ל-100 milliliters של acetone. שטפו את הכדורים ב-acetone עד להסרה מלאה של הפאזה השומנית.

לאחר מכן ייבשו את הכדורים שהופקו בוואקום. בצעו ייבוש דסייקטורי וקבעו את גודל החלקיקים הממוצע של ה-CSM, את שטח הפנים למיליגרם ואת הנפח השמערִי באמצעות מנתח גודל חלקיקים. המשיכו לשטוף את ה-CSM שלוש פעמים במים סטריליים כדי להסיר מלחים שנותרו.

כעת יש לעקר את תמיסת ה-CSM באמצעות אלכוהול מוחלט לשימוש בניסויי תאים; במבחנה מזכוכית בנפח 50 מיליליטר, ערבבו 5 mg של מיקרוספירות עם 1 mL של תמיסת 0.5% TNBS והדגירו למשך ארבע שעות ב-40 °C. לאחר מכן, הוסיפו 3 mL של חומצה כלורית בריכוז 6N והדגירו ב-60 °C למשך שעתיים. לאחר קירור הדגימות לטמפרטורת החדר, הוסיפו 5 mL של מים דאיוניים ו-10 mL של דיאתיל אתר.

כדי למצות את ה-TNBS החופשי, הוצאו מנה של 5 mL מהפאזה המימית וחממו ל-40 °C במסבב מים למשך 15 דקות כדי לאדות את שאריות האתר, לאחר קירור לטמפרטורת החדר. דללו עם 15 mL מים. מדדו באמצעות ספקטרופוטומטר את הבליעה של מיקרוספירות הקיטוזן שהוכנו באורך גל של 345 nm, כאשר TNBS משמש כבנק (blank).

מדדו גם את הכיטוזאן ששימש להכנת ה-CSM. כעת, חשבו את מספר קבוצות האמינו החופשיות של ה-CSM ביחס למספר הכולל של קבוצות האמינו בכיטוזאן. השרו חמישה מיליגרם של ה-CSM שעוקcarpeta ב-HBSS סטרילי למשך לילה.

העבירו את ה-CSM למבטיב ממברנה של שמונה מיקרון עבור פלטות תרבית של 24 בארות. לאחר שה-CSM שקעו, שאבו בזהירות את ה-HBSS. כעת הוסיפו 300 µL של מצע גידול לחלק הפנימי של המבטיב, ו-700 µL של מצע גידול לחלק החיצוני של המבטיב.Resus.

שעלק את התאי הגזע המופקים מרקמת שומן ב-200 microliters של מצע גידול וזריע אותם על ה-CSM בתוך פלטת התרבית. הכנס לדגירה למשך 24 שעות באינקובטור לח עם 5% carbon dioxide בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. העבר את ה-CSM הטעון ב-SC למבחנה סטרילית של מיקרו-צנטריפוגה, מבלי להפריע לתאים שנדדו אל תוך ממברנת המבנה.

כעת יש להסיר את המצע השארי ולהוסיף 250 µL של מצע גידול טרי לכל מבחנה. הוסיפו 25 µL של תמיסת MTT בריכוז 5 mg/mL והדגרירו למשך ארבע שעות. הסירו את המצע והוסיפו 250 µL של dimethyl sulf oxide וערבבו במערבל Vortex כדי להמיס את קומפלקס הפורמזן; סבבו בצנטריפוגה את ה-CSM ב-2,700 ×g למשך חמש דקות.

מדוד את בליעת האור (absorbance) של העלייה ב-570 ננומטר, תוך שימוש ב-630 ננומטר כרפרנס. המשך בקביעת מספר התאים הקשורים ל-CSM ביחס לערך הבליעה שהתקבל ממספרים ידועים של A SC חיים. ערבב חמישה מיליגרם של CSM טעון ב-A SC עם 7.5 מיליגרם למילליטר של קולגן מסוג one collagen שהופק מחולדות.

גיד זנב, כוונן את ה-pH ל-6.8 באמצעות נתרן הידרוקסיד בריכוז 2N ושפוך לתוך צלחת תרבית. הכנס לערבוב (fibrillate), כעת העבר לצלחת 12 בארות והדגר למשך 30 דקות. המשך לרענן את המצע עבור ג'לי collagen A-S-C-C-S-M מדי יומיים במהלך תקופת ההדגרה.

יש לנטר גם את השחרור ואת נדירת התאים מתוך ה-CSM אל תוך הג'ל באמצעות טכניקות מיקרוסקופיה סטנדרטיות. הדוגמה הבאה מתארת את האסטרטגיה in vitro להעברת תאי גזע המופקים מרקמת שומן מתוך מיקרוספירות קיטוזן אל תוך פיגום של ג'ל קולגן. תמונות SEM ו-TEM מעידות על הכנה של CSM נקבובי בעל גודל אחיד.

דגירה של המיקרוספירות עם תאי גזע ראשוניים המופקים מרקמת שומן מעידה על 4,000 תאים למיליגרם של CSM calcium am. צביעה של SC מראה פריסה על פני ה-CSM עם פילופודיה המתרחבים אל תוך הסדקים הפוריים של המיקרוספירה. כאשר ה-CSM הטעון בתאים ערבב עם ג'ל קולגן, התאים נדדו אל תוך הג'ל וניתן היה לעקוב אחריהם לאורך זמן.

ההשלכות של טכניקה זו מתרחבות באופן מיידי לטיפול באובדן רקמה נרחב וכרוני. עם זאת, למשטר טיפולי זה פוטנציאל רב יותר הודות לרב-גוניותו באינטגרציה עם מגוון של תאים ו/או ביו-חומרים המשמשים לטיפול ברמות שונות של אובדן רקמות רכות ורקמת לב. ניתן להסיק כי שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי הובלה של תאי מאכסן.

ניתן ליישם זאת גם במערכות אחרות, כגון תכשירים להזרקה, להעברת תרופות טיפוליות, או לפיתוח מערכות היברידיות להעברה משותפת של תאים ותרופות טיפוליות.