פעילויות הדמיה ריח ועוררה הנורה חוש הריח באמצעות עכבר אופטי החזר אותות autofluorescence
31 באוקטובר 2011
מאמר זה מציג את הפרוטוקולים של אותות אופטיים flavoproteins מהותי autofluorescence הדמיה אותות ריח עורר פעילויות המפה על פני השטח של הנורה חוש הריח אצל עכברים.
המטרה הכללית של ניסוי זה היא למפות פעילויות המושרות על ידי ריח על פני השטח של הפקעת הרחב של עכברים, באמצעות אותות אופטיים אינטרינסיים ואותות אוטופלואורסצנציה של פלבופרוטאין או דימוי FAS, לאחר הרדמת העכבר וחשיפת הגולגולת. העצם שמעל הפקעת הרחב נדחקה. פתח בעצם נחתך באמצעות קצה של להב סכין ניש तर וסולק, ולאחר מכן נוצר תא מבטון דנטלי המקיף את פני השטח החשופים של הפקעת הרחב.
ממלאים אותו ב-aros ומניחים זכוכית כיסוי מעל להכנה זו. מפות ריח נרכשות באופן רצופי באותה עכבר באמצעות אותות אופטיים פנימיים והדמיית FAS. הדמיה של פעילויות מעוררות אחרות בבצול ריח של העכבר באמצעות אותות השתקפות אופטית ואוטופלורסצנציה יכולה לסייע במתן תשובות לשאלות מפתח הנוגעות לארגון המרחבי של סדרי הריחות בבצול ריח. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון הדמיית 2-DG (דוקסי-גלוקוז) או fMRI, הוא היכולת להקליט פעילויות מעוררות של ריחות ברזולוציה מרחבית של גלומרולוס בודד.
באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בשיטות אלו ייתקלו בקשיים בתחילת עבודתם, שכן רכישת המיומנויות הכירורגיות והמכשוריות היא תהליך איטי. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית כדי להפנות את תשומת הלב לשלבים המכריעים בהליכים הכירורגיים ובדיקות הדימות. צבטו את כף הרגל האחורית של העכבר כדי לוודא הרדמה, והסירו את הפרווה מהקרקפת באמצעות מכונת תספורת.
נגבו שירי פשפש מהעור בעזרת רפידות גזה סטריליות הספוגות במים מזוקקים. מקמו את העכבר במסגרת הסטריאוטקסית כך שהחלק הקדמי של האף יהיה במישור אחד עם החלק האחורי של הראש. כדי למקם את הבצול האופולקטורי (olfactory bulb) באופן אופקי, הדקו היטב את מוטות האוזניים והאף כדי למנוע תזוזה.
יש למרוח פומד עיני לעיניים כדי למנוע התייבשות במהלך הדמיון, ולאחר מכן לחטא את אזור הקרקפת עם Betadine באמצעות מספריים סטריליים. יש לבצע חתך בחלק האחורי של הראש בין האוזניים, ואז לחתוך משני הצדדים לכיוון בסיס האוזן ובכיוון קדמי-אחורי לעבר המצח לאורך העפעפיים. השלימו את הסרת הקרקפת על ידי חיתוך העור באזור האף.
השתמשו בסורג האף כמדריך. מקמו את בעל החיים תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופי והשתמשו במקלון צמר ספוג בסליין כדי להסיר בעדינות את הפריאוסטום (periosteum) מחלקו העליון של הגולגולת. השתמשו בפינצטה להסרת הרקמה שנותרה וגרדו את פני השטח של הגולגולת באמצעות סכין ניתוח כדי להבטיח הכנה נקייה, במטרה לשמור על אזור הבצבע הריחני (olfactory bulb) לח לאורך כל הניסוי.
הניחו פיסת ספוג ג'לטין ספיג, שהרוויחו במים מזוקקים, על העצם מעל הפקעת הריחית הממוקמת בין העיניים. הסירו את ספוג הג'לטין והתחילו בגירוד עדין של העצם באמצעות להב סכין מנתחים מסוג 10. שמרו על זווית קבועה של 45 מעלות בין הלהב לעצם והזיזו את הלהב מהעפעפיים לכיוון הצד הסגיטלי של אזור הפקעת.
יש להקפיד שלא להפעיל לחץ אנכי על העצם או לשרוט את העצם מעל הסינוס הורידי במהלך תהליך הדילול. יש לעצור מדי חמש דקות ולהניח ספוג ג'לטין לח על העצם כדי לקרר את הדגימה. יש להעביר את הספוג על הגולגולת כדי להסיר שיירי עצם ואבק, ולניגוב את קצה הסקלפל באופן מחזורי כדי לשמור עליו נקי וחד.
המשיכו עד ששכבת העצם הספוגית או הטרבכולה (trabecula) תהיה גלויה. כאשר רשת כלי הדם העדינה של הבצל הריחני נראית לעין, הפסיקו את גירוד העצם והשתמשו בקצה של סכין מנתחים מספר 11 כדי לסמן שטח מלבני סביב הבצל הריחני. תוך שמירה על החלון בתוך גבולות הסינוסים הוורידיים, המשיכו לגרד את העצם בתוך השטח המלבני.
היו זהירים במיוחד לגבי עומק קצה הסקלפל כדי להימנע ממגע עם פני השטח של הקשיה (dura). כדי להערך את עובי העצם הנותרת, דחפו אותה בעדינות באמצעות קצה של פינצטה. אם העצם נשברת תחת הלחץ, עברו לשלב הבא.
הוסיפו טיפה של תמיסת מלח והשתמשו בקצה הסכין (scalpel) המכוון אופקית כדי להרים את מקורי הגומה (bone flap). הסירו בזהירות את המקורי באמצעות פינצטה כדי למנוע קריעה של העצם שנותרה. ברגע שפני הש bulb האולפקטורי (olfactory bulb) חשופים, ודאו שאין דימומים או כלי דם. אנסטומוזיס.
נגב את האזור בעזרת ספוג ג'לטין ספוג במלח פיזיולוגי. על מנת לשמור על הבצל האפטירי (olfactory bulb) לח, מרח מלט דנטלי מפוליאקרילאט באמצעות מזרק בנחיר 29 כדי ליצור דופן על העצם מסביב לחלון הגולגולת. הנח טיפה של אגרוס (aros) בעל נקודת התכה נמוכה מעל הקשה (dura) והנח זכוכית כיסוי סטרילית מעל חלון הגולגולת לצורך הדמיה.
הניחו את המסגרת הסטריאוטקסית תחת המיקרוסקופ הסטריאו, כאשר החלון הגולגולתי ממוקם במרכז שדה הראייה, וכוונו את הפוקוס כדי להביא את הנימים למבט. עברו לתאורה ירוקה של 580 nanometer וצלמו תמונת בקרה אנטומית כדי לבדוק את מצב ההכנה במהלך ההדמיה. לאחר מכן, המשיכו לצילום ניסיונות הגירוי באמצעות הדמיית אות אופטי אינטרינזי תחת תאורה של 630 nanometers, או הדמיית אות אוטופלואורסצנציה של פלאבופרוטאין תחת תאורה של 480 nanometers. סשן הדמיה סטנדרטי כולל קו בסיס של 5 עד 10 שניות שבהן מוגש אוויר בלבד, ולאחריו גירוי בריח למשך 3 עד 10 שניות, בהתאם לריכוז הריח שנבחר.
ולבסוף, נרשמים 70 עד 82 שניות של אספקת אוויר עבור התאוששות לבסיס. כאן, מערכת כלי הדם של הפחית ריחית מצולמת דרך החלון הגולגולתי, ולאחריה תוצאות של ניסוי גירוי המשתמש ב-h sinal כחומר ריח, אשר תועדו באמצעות הדמיית iOS וגם הדמיית FAS. בשימוש בהדמיית iOS, פעילות המעוררת ריח מוצגת כאזורים כהים של בליעה; אזורים שהופעלו על ידי AL מסומנים על ידי החצים הלבנים, וניתן לראות אזורים פעילים הן בניסויים בודדים והן בממוצע של מספר ניסויים.
מעבר לדימוי FAS באותו עכבר מראה כעת פעילות שעוררה OD כאזורים לבנים של פליטת אוטופלואורסצנציה המסומנים על ידי החיצים השחורים, וניתן לראותה הן בניסויים בודדים והן בממוצע של מספר ניסויים. שימו לב כי הן אזורי הבליעה השחורים שנראים באמצעות דימוי iOS והן האזורים הלבנים של פליטת אוטופלואורסצנציה שנראים באמצעות דימוי FAS חופפים. התאמה מרחבית זו מאשרת ששתי הטכניקות מאפשרות ויזואליזציה של אותם גלומרולי אולפקטוריים. ברגע שנקבע סדר הדימוי, ניתן לבצע מיפוי של פעילויות שעוררו באמצעות אותות רפלקטנציה אופטית ואוטופלואורסצנציה תוך שעה אחת לניתוח ומספר שעות לרכישת תמונות.
החסרונות העיקריים בשימוש בשיטות דימות אופטיות אלו הם העובדה שלא ניתן להחיל אותן כדי להמחיש מפות ריח בעכברים הנעים באופן חופשי. ובשל החדירה המוגבלת של פוטונים לרקמות ביולוגיות, הן אינן מאפשרות גישה לגלומרולוסי הריח הוונטרליים לאחר התפתחותם בשנות התשעים המאוחרות, להקלטת אותות פנימיים במערכת הריח. אולי זוהי דרך עבור חוקרים בתחום הדימות האופטי לחקור את מאפייני הציפוי המיוחד של הריח.
דימות פלואורסצנציה עצמית של פלבופרוטאין בפקעת הריח הוא טכניקה מבטיחה למתן תובנות חדשות לגבי הציפוי המיוחד של OD באמצעות אותות אופטיים אנדוגניים.
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקולים לדימות של אותות אופטיים אינטרינסיים ואותות אוטופלואורסצנציה של פלבופרוטאינים, במטרה למפות פעילות המעוררת על ידי ריח על פני השטח של הפקעת הריח בעכברים. השיטות המתוארות מאפשרות דימות ברזולוציה גבוהה של פעילות הפקעת הריח, ומספקות תובנות לגבי המנגנונים העצביים של חוש הריח.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- עיבוד ריח
- טכניקות דימוי
רקע
- הבנת העיבוד האולפקטורי חיונית להשגת תובנות לגבי תפיסה חושית.
- טכניקות דימיון כגון אותות אופטיים אינטרינזיים ואוטופלורסצנציה של פלביפרוטאינים הן בעלות ערך לחקר פעילות המוח.
- מיפוי של פעילויות המעוררות על ידי ריחות יכול לחשוף את הארגון המרחבי של תגובות חושיות.
- ייתכן ששיטות קיימות חסרות את הרזולוציה הדרושה לניתוח מפורט.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוטוקול למיפוי פעילות המעוררת על ידי ריח בבצולפת הריחית.
- שימוש באותים אופטייםו עצמיים ובאוטופלואורסצנציה של פלאבופרוטאינים לצילום ברזולוציה גבוהה.
- הדגמת היתרונות של טכניקות דימות אלו לעומת שיטות מסורתיות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- העכברים מוהרדמים ומוכנים להדמיה על ידי חשיפת הפחbullying הריחית (olfactory bulb).
- העצם שמעל הפחbullying הריחית נדללת כדי לאפשר הדמיה.
- הדמיה רצפית לוכדת תגובות לגירוי ריח באמצעות אותות אופטיים אינטרינזיים ואוטופלואורסצנציה של פלבופרוטאינים.
- מפגשי ההדמיה כוללים שלבי בסיס (baseline) ושלבי גירוי ריח להערכת פעילויות מעוררות.
תוצאות עיקריות
- פעילויות המעוררות על ידי ריח מוצגות ויזואלית כאזורי בליעה ואוטופלואורסצנציה.
- התוצאות מראות דפוסי הפעלה מובחנים בתגובה לריחות שונים.
- שתי טכניקות ההדמיה מספקות מידע משלים על פעילות הפקעת הריח.
- רזולוציה מרחבית גבוהה מאפשרת מיפוי מפורט של תגובות חושיות.
מסקנות
- הפרוטוקולים שפותחו מאפשרים מיפוי יעיל של פעילות בבצל הריח.
- אותות אופטיים פנימיים ואוטופלורסצנציה של פלבופרוטאינים הם כלים עוצמתיים למחקר במדעי המוח.
- שיטות אלו יכולות להעמיק את הבנתנו לגבי עיבוד חושי במוח.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
מיפוי פעילות עצבית המעוררת על ידי ריח בבצל האפופטי (olfactory bulb) תומך בתיקוף מטרה (target validation) בתהליך גילוי תרופות במדעי המוח, בכך שהוא מאפשר ויזואליזציה של מעגלים עצביים תפקודיים המעורבים בעיבוד חושי. גישה זו מספקת הפחתת סיכונים מנגנונית (mechanistic de-risking) עבור תרכובות המכוונות למסלולים אפופטיים או להפרעות נוירולוגיות קשורות, על ידי קישור התערבויות מולקולריות לשינויים מדידים בדפוסי הפעלה עצביים. הטכניקה מגבירה את הביטחון החזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי הצעת מערכת רלוונטית למחלה להערכת מעורבות המטרה (target engagement) והשפעות ברמת המעגל לפני ביצוע סריקה פנוטיפית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות על ידי ויזואליזציה של דפוסי הפעלה המעוררים על ידי ריח בגלומרולי כמודולים פונקציונליים של עיבוד חושי.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות תצפית ישירה על מעורבות מעגלים עצביים בתגובה לגירויים חושיים.
- ערך ניבוי: מסייע בתיעדוף תיקי פיתוח על ידי קישור בין מודולציה של מטרה לשינויים מדידים במפות הפעלה מרחביות.
סריקה ופיתוח בדיקות
- ערך מדעי: מכין מערכות ביולוגיות מתוקפות עבור תהליכי עבודה המשכיים על ידי קביעת פרופילי פעילות בסיסיים ומעוררים בפח bulb olfactory.
- ערך תפעולי: נותן מענה לסטנדרטיזציה ושחזור של הבדיקה באמצעות הדמיה רצופית של אותות אופטיים אינטרינזיים ואוטופלורסצנציה של פלבופרוטאין תחת גרייה מבוקרת.
- יכולת הרחבה: מדגיש את אפשרות השימוש החוזר בפלטפורמה לאורך ניסויי גרייה וריחות שונים, כדי לאפשר הערכה מהימנה של תרכובות במדעי העצבים החושיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- המשכיות תרגומית: דן ברלוונטיות למחלה על ידי קישור דפוסי הפעלה של הפלגה ריחית למסלולי עיבוד חושי הרלוונטיים להפרעות נוירולוגיות.
- הפחתת סיכונים מכניסטית: מתאר המשכיות משלב הגילוי ועד לאישור פרה-קליני באמצעות מיפוי תגובות עצביות המשקפות שינויים בפעילות המוח המתווכים על ידי המטרה.
- קידום מותאם סיכונים: תומך בקבלת החלטות על ידי אספקת קריאות מרחביות כמותיות המתואמות עם תוצאות תפקודיות.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מבדיקת השערות בשלבי הגילוי המוקדמים ועד לזיהוי מובילים (lead identification) ותיקוף פרה-קליני, על ידי אספקת מדדים של פעילות עצבית המגבירים את הוודאות לגבי המטרה ואת ההבנה המכניסטית.
- ביולוגיה של גילוי: מסביר כיצד השיטה תומכת בבדיקת השערות, הבהרת מסלולים והפחתת סיכונים ביולוגיים באמצעות ויזואליזציה של הפעלה בעקבות ריח בגלומרולי.
- סריקה: מתאר את מוכנות הבדיקה, השחזוריות ותפוקות כמותיות באמצעות דימוי רציף של קו בסיס וגירוי תחת תאורה של 630 nm ו-480 nm.
- אנליטיקה: מדגיש מדידות כגון שינויים בבליעה (אותות אופטיים אינהרנטיים) ופליטת אוטופלואורסצנציה (אותות פלבופרוטאין) המאפשרים השוואה של הפעלה עצבית בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר את השיטה לרציפות פרה-קלינית על ידי קישור דפוסי הפעלה בבצולולת הריח למסלולי עיבוד חושיים הרלוונטיים ליעדים טיפוליים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציג את השיטה כיכולת הניתנת לשימוש חוזר למחקרים ארוכי טווח ולהשוואה בין תרכובות שונות באותה דגימה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון ניבוי, תיקוף מטרות, וצמצום עמימות מכניסטית במסלולי עיבוד חושי.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה, הדירות ויכולת הרחבה של מיפוי פעילות עצבית בין ניסויים ונבדקים.
- ערך אסטרטגי: קבלת החלטות משופרת לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go), יעילות הון וצמצום סיכונים ביולוגיים בשלבים מאוחרים בתוכניות מדעי המוח.
- השפעה על הפורטפוליו: תעדוף וקבלת החלטות קידום מותאמות לסיכון, בהתבסס על ספי סכסול עצבי ודפוסים מרחביים.
שיקולי יישום
- מומחיות מדעית נדרשת במדעי העצבים, הכנה כירורגית וטכניקות של דימות אופטי.
- דרישות לתשתיות אנליטיות וציוד, כולל מסגרת סטריאוטקטית, מיקרוסקופ סטריאו, מקורות אור ב-580 nm, 630 nm ו-480 nm, ומערכות לרכישת תמונות.
- דרישות לסטנדרטיזציה בין צוותים עבור ההכנה הכירורגית, עומק ההרדמה ופרמטרי הדימות בין מעבדות שונות.
- שיקולי התאמה בין מערכות מודל, תוך ציון היישום הנוכחי בבצל הריח של עכבר עם פוטנציאל להרחבה לאזורים תחושתיים אחרים.
- מגבלות מעשיות הנתמכות בחומר המקור: חוסר יכולת להדמיות של מפות ריח בעכברים הנעים בחופשיות וחדירות פוטונים מוגבלת המגבילה את הגישה לגלומרולי ריח ונטרליים.
