ניתוח התגובות של נוירונים עכבר חוש הריח חושי באמצעות הקלטה אוויר שלב Electroolfactogram

דגימה של אפיתל ריחוני מורכבת על צלחת ומוצבת בזרם של אוויר מלחח. תחת מיקרוסקופ דיסקציה, אלקטרודת ייחוס מחוברת חשמלית לרקמה באמצעות תמיסת בופר. אלקטרודת רישום ממוקמת על פני השטח של האפיתל הריחוני.

האפיתולרי הריחית מעוררת על ידי נפיחות של חומרי ריח הנשלטות במחשב המועברות בזרם של אוויר לח, הנושא את חומרי הריח אל האפיתולרי הריחית. אותות EOG מועברים דרך מגבר וממיר דיגיטלי למחשב ההקלטה. שלום, אני קתרין סיאר מהמעבדה להיגיינה XO במחלקה לביולוגיה באוניברסיטת ג'ונס הופקינס.

היום נדגים לכם פרוצדורה להקלטת אלקטרו-אולפקטוגרמה מעכברים. אנו משתמשים בפרוצדורה זו במעבדה שלנו כדי לחקור את תגובותיהם של נוירונים תחושתיים ריחוניים לריחות. אז בואו נתחיל.

מערכת ההקלטה מורכבת מאלקטרודת הקלטה, אלקטרודת ייחוס, צינור להולכת אוויר, במת דגימה ומיקרוסקופ לדיסקציה, כאשר כולם מעוגנים על שולחן אוויר בתוך כלוב פאראדיי. מיקרו-מניפולטורים משמשים למיקום האלקטרודות בתוך צינור הולכת האוויר. זרם אוויר רציף מועבר בבעבוע דרך מים מזוקקים להוספת לחות, לפני מעברו בצינור הולכת האוויר ומעל הדגימה.

צלוחית תרבית של 60 מילימטר הממולאת בסיליקון בעובי של שישה עד שמונה מילימטרים משמשת כמשטח קיבוע לדגימה. באגן הקיבוע חללנו בתוך הסיליקון באר ותעלה, כדי לספק אמצעי לחיבור חשמלי של אלקטרודת הייחוס לדגימה באמצעות תמיסת רינגר משופרת.

אלקטרודות ההקלטה והייחוס מחוברות למגבר. אותים מהמגבר נשלחים לממיר אנלוגי-דיגיטלי (digitizer) ולאחר מכן למחשב. תוכנת XI graph משמשת לשליטה בפרוטוקול הגירוי, להקלטת האות ולניתוח התגובות.

אוסצילוסקופ מחובר לאחר המגבר לצורך ניטור בזמן אמת של הפוטנציאל החשמלי בזמן מיקום אלקטרודת ההקלטה ובמהלך הקלטות EOG. הגשת גירויי הריח נשלטת על ידי pico spritzer, המחובר לאותו מחשב המשמש לרכישת האות רגע לפני הגשת גירוי הריח.

מוצא ה-pico spritzer מחובר לבקבוק ריח המכיל חומר ריח נוזלי. הבקבוק מחובר לאחר מכן לצינור הזרמת האוויר. כעת נראה כיצד להכין אלקטרודות לניסויי הקלטה.

אלקטרודת ההקלטה היא תיל כסף-כלוריד בתוך קפילרה מזכוכית שנמשכה ומולאה בתמיסת רינגר משופרת. אלקטרודת הייחוס היא תיל כסף-כלוריד. התחילו בהכנת שתי האלקטרודות על ידי התקנת תיל כסף במחזיק האלקטרודה.

עבור אלקטרודת ההקלטה, על חוט באורך של סנטימטר אחד עד שניים לבלוט מקצה מחזיק האלקטרודה. ניתן להשאיר חוט ארוך יותר עבור אלקטרודת הייחוס. כדי להוסיף את ציפוי כסוף הכלוריד, מקמו את החוט ב-0.1 molar sodium chloride וחברו את מחזיק האלקטרודה לקוטב החיובי של מקור מתח DC של 1.5 עד תשעה וולט.

יש לחבר חשמלית את הקוטב השלילי של מקור המתח לתמיסת נתרן כלורי בריכוז 0.1 molar. יש להמתין 10 דקות להמשך התגובה של הכלוריד כדי להשוות את כל מטען הסטטי שבין אלקטרודת הרישום לאלקטרודת הייחוס. יש להשחית את האלקטרודות זו בזו לזמן קצר לפני התקנתן על מכשיר הרישום.

בשלב הבא, משכו קפילרה מזכוכית באמצעות מכשיר למשיכת מיקרו-פיפטות. פתח קצה הקפילרה צריך להיות בקוטר של כ-5 עד 10 מיקרון. השתמשו בעיפרון יהלום כדי לסמן ולשבור את הקצה התעומת של הקפילרה, כך שתהיה ארוכה בכשני סנטימטרים מחוט הכסף.

השתמשו בלהבת בוטאן כדי לבצע ליטוש באש לקצה החתוך, ולאחר מכן המסו 0.5% agros בתמיסת רינגר משופרת. השתמשו בפיפטת העברה כדי למשוך כמות קטנה של תמיסת agro מותכת אל קצה האלקטרודה, באמצעות מזרק שחומם ונמשך כדי ליצור קצה דק וארוך. מלאו את הקפילרה הנמשכת עד למחצית מגובהה.

בעזרת תמיסת ריינגר משונה, הקש בעדינות על הקפילרה כדי להוציא בועות אוויר. אחסן את האלקטרודה המלאה בצנצנת אחסון המכילה כמות קטנה של תמיסת ריינגר משונה בתחתיתה עד למועד השימוש. לאחר שדגימת הרקמה הוכנה והיא מוכנה להקלטה, התקן קפילרה מלאה מעל חוט אלקטרודת ההקלטה עם האלקטרודות המוכנות.

בואו נבחן ניסוי הקלטה כדי להתחיל בהכנת רקמה להקלטה. הסירו את העור המכסה את גולגולתו של עכבר שהוקרב וחצו את הראש לשניים לאורכה לאורך קו האמצע; מקמו מחצית אחת של הראש, כאשר הצד המדיאלי פונה כלפי מעלה, על צלחת הקיבוע. הסירו בזהירות את המחיצה כדי לחשוף את הטורבינאטים.

הנח את הצלחת עם הרקמה המקובעת על במת ההקלטה. כוונן את הבמה כך שמיקום ההקלטה על הקונכיות יהיה ממורכז תחת המיקרוסקופ. כעת פתח את מיכל האוויר כדי להזרים אוויר מלחח בקצב של כ-600 milliliters per minute אל פני השטח של הקונכיות.

מקמו את צינור הזרמת האוויר כך שיהיה במרחק של כ-10 millimeters ממיקום ההקלטה. הגדירו את המגבר למצב DC, שכן הגברה במצב AC תגרום לארטיפקטים באות ה-EOG. בצעו רכישת נתונים עם מסנן מעביר נמוכים (low pass filter) של one kilohertz והגבר של 100 x.

כעת התקינו את אלקטרודות ההקלטה והייחוס על המיקרו-מניפולטורים. הורידו את אלקטרודת הייחוס אל תוך הבאר שבצלוחית ההרכבה וכסו אותה בתמיסת רינגר משופרת כך שתהיה מחוברת חשמלית לרקמה. הורידו בזהירות את אלקטרודת ההקלטה אל פני השטח של turbinate 2B או 3.

האלקטרודה צריכה לגעת קלות במשטח של אפיתל הריח. כאשר האלקטרודה תיכנס במגע עם האפיתל, תופיע קו בסיס ישר באוסצילוסקופ. כעת, חברו בקבוק עם חומר ריח לפתח הצדדי בצינור הזרמת האוויר במחשב.

התחל פרוטוקול גירוי. קצב הדגימה עבור רכישת הנתונים צריך להיות 2 kHz או גבוה יותר. התוכנה תפעיל פולס של ריח ותתחיל בהקלטה.

פרוטוקול גרייה טיפוסי עשוי לכלול פולס בודד מוצמד במשך 100 מילישניות, פולסים של 100 מילישניות המופרדים במרווח של שנייה אחת, או פולס רציף של עשר שניות. כדי למזער אדפטציה, המתינו בין דקה לחמש דקות בין הפרוטוקולים לאחר מתן ריכוזי ריח גבוהים. ריח שיורי עלול להישאר בצינור; שטפו את צינור האוויר עם 95% ethanol וייבשו אותו לפני המשך העבודה עם דגימות רקמה נוספות.

תוכנת Axo graft מספקת כלים למדידת פרמטרים מרכזיים של אות ה-EOG. פרמטרים אלו כוללים את אמפליטודת התגובה, זמן השהיה (latency), הזמן עד לשיא וקבועי זמן של סיום. מספר פרמטרים של ה-EOG שימושיים במיוחד להשוואת תגובות מנורמלות בין עכברים, כולל אמפליטודת התגובה, זמן העלייה של השהיה, הזמן עד לשיא וקבוע זמן של סיום.

מוצגים כאן OGs מעכבר בתגובה לגירוי בריכוזים עולים של amyl acetate נוזלי. הקו השחור בחלק העליון מציין את התזמון ואת משך גירוי הריח. כאן אנו רואים קשר של תגובה למינון הממוצע מחמישה עכברים; פסי השגיאה מייצגים רווחי סמך של 95%.

ירידה באמפליטודת השיא נצפית לעיתים קרובות בריכוזי ריח גבוהים מאוד. דוגמה ל-EOG בתגובה לגירוי של פולס זוגי מוצגת; פולס קצר בודד של חומר ריח מעורר אדפטציה הנמשכת מספר שניות. מוצג כאן EOG בתגובה ל-10 שניות של גירוי מתמשך של חומר ריח.

ה-EOG מראה דסנסיטיזציה במהלך הצגה רציפה של חומר ריח. הרגע הדגמנו כיצד להקליט את האלקטרודפקטרוגרמה מעכברים. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להניח את האלקטרודה בדיוק על פני השטח של האפיתליום ולא להחדיר את האלקטרודה מתחת לפני השטח.

יש להקליט תמיד מאותו צד של הראש ולהימנע משינויים במערך הניסוי כדי לצמצם שונות; שמרו על הרקמה לחה, אך ללא הצטברות של טיפות נוזל. הנחת הרקמה תחת זרימת אוויר לח מיד לאחר הניתוח תשמור על הרקמה במצב מיטבי להקלטה. זהו כל הפרוטוקול. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.