Multiplex זיהוי של חיידקים דוגמאות מורכבות קלינית הסביבה באמצעות oligonucleotide מצמידים פלורסנט microspheres

שלום, אני Tim Duso מ-Agriculture and AgriFood Canada. בסרטון זה, נדגים פרוטוקול לקביעת הנוכחות והשכיחות של מיקרואורגניזמים ספציפיים בדגימה קלינית או סביבתית מורכבת באמצעות מכשיר bio plex. פרוטוקול זה משתמש בחרוזי פוליסטירן פלואורסצנטיים המצומדים כימית לגשש oligonucleotid ספציפי למין.

אמפליקון נוצר מהדגימה באמצעות פריימרים אוניברסליים ל-PCR, והאמפליקון עובר היברידיזציה לחרוזי בדיקה (probe coupled beads). מכשיר ה-bio plex מייצר שני אותות: אחד מזהה את החרוד והשני מכמת את אות ההיברידיזציה.

המטרה הכוללת של הפרוצדורה היא לקבוע פרופיל של המיקרוביוטה הרלוונטית באופן מהיר וחצי-כמותי. יישמנו טכניקה זו כדי לקבוע פרופילים בקטריאליים בסוובי נרתיקיים, ולהשתמש בנתונים שהופקו כדי לאבחן וגינוזיס בקטריאלי (bacterial vaginosis) – מצב קליני המאופיין בשינוי במיקרוביוטה, שבו אורגניזמים מסוג lactobacillus הופכים לפחות שכיחים ואורגניזמים אחרים, כגון Gardnerella, vais, ו-apoian vae, הופכים לניתנים לגילוי בסוובים נרתיקיים. עם זאת, חשוב לזכור שניתן ליישם טכניקה זו על כל מיקרוביוטה אחרת עבורה רצוי ביצוע בדיקת multiplex מהירה.

נתחיל בתיאור אופן פעולת הפרוצדורה. פרופיל מיקרוביאלי נוצר על ידי הגברה של גן ה-chaperone של חלבון וכיסוי ב-60 מכל האורגניזמים הנוכחים בתמצית DNA של מטוש. אחד הפריימרים להגברה אוניברסלית שונה על ידי הוספת ביוטין, וכן על ידי הכללת בסיסים משונוים בפוספט.

בקצה ה-5', האמפליקון הופך לחד-גדילי באמצעות T seven exonuclease, המפרקת רק את גדיל ה-antisense. מכיוון שגדיל ה-sense מוגן על ידי פריימר PCR עם מודיפיקציית פוספט, פרובים אוליגוניוקלאוטידיים המשלימים לגדיל שנותר מקושרים באופן קוולנטי לחרוזי פוליסטירן פלואורסצנטיים. מכיוון שכל צבע חרוז ייחודי מכיל פרוב המזהה אורגניזם שונה, ניתן להשתמש בעד מאה חרוזים שונים עבור דגימה בודדת.

תוצר ה-PCR בעל הגדיל הבודד מ swabs נרתיקי עובר היברידיזציה עם תערובת חרוצים המחוברים לגשושים, הכוללת גשושים עבור כל האורגניזמים הרלוונטיים. מתווסף רפורטר פלואורסצנטי FICO ethin, הנקשר לגשושים הביוטיניליים באמצעות צמיד strep din. לבסוף, תערובת ההיברידיזציה מנותחת במכשיר luminex או bio plex, הבוחן כל חרוץ באופן פרטני לצורך זיהוי ובדיקת אות ההיברידיזציה.

תוצאות ניתוח זה מעידות על נוכחותם של מיקרואורגניזמים ספציפיים, ועוצמת אות ההיברידיזציה תואמת את שכיחותו של אותו אורגניזם. בדגימה, ניתן להשתמש בנוכחותם של אורגניזמים הקשורים ל-BV כדי לאבחן bv. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון צביעת Gram, הוא שהיא מייצרת מידע על נוכחותם של מיקרואורגניזמים ספציפיים ועל שכיחותם.

ג'ניפר טאון, עוזרת מחקר במעבדה שלנו, תדגים את הפרוצדורה. השביה מחדש את המיקרוספירות על ידי ערבול ב-vortex למשך כ-20 שניות. העבר 400 µL של מיקרוספירות לשפופרת צנטריפוגה מסוג Eppendorf, צנטריפוגה במהירות של 14,000 ×g למשך דקה אחת, הסר והשלך את הנוזל העליון. השביה מחדש את המיקרוספירות ב-50 µL של 0.1 M MES pH 4.5.

הוסיפו אחת מנחית (aliquot) של אוליגו לכידה למיקרוספירות וערבבו באמצעות וורטקס. הוסיפו 2.5 µL של תמיסת EDC טרייה למיקרוספירות. דגרו את התגובה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות בחושך.

השליכו את תמיסת ה-EDC שהוכנה קודם לכן והכינו דגימה טרייה של 10 milligrams per milliliter EDC במים. כפי שנעשה לעיל, הוסיפו 2.5 microliters נוספים של תמיסת EDC טרייה למיקרוספירות וערבלו במערבל וורטקס למשך חמש שניות. דגרו שוב בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות בחושך.

שטפו את החרו지를 על ידי הוספת 1 ml של 0.02% Tween 20, ערבבו ב-vortex כדי להחזיר את החרוזים לתליה, וסובבו בצנטריפוגה ב-14,000 ×g למשך דקה אחת; הסירו והשליכו את הנוזל העליון. שטפו את החרוזים שוב על ידי הוספת 1 ml של 0.1% SDS. תלו את החרוזים ב-100 µL של באפר TE.

ספרו את החרו지를 ב-hemo cytometer כדי לקבוע את ריכוז מלאי החומר. הכינו תערובת מאסטר של מיקרוספירות על ידי דילול של כל סוג חרוז לריכוז סופי של 100 חרוזים ל-µL בתוך מאגר הבופר. שלבו את החרוזים המצומדים בהתאם למספר ה-plex הרצוי של הבדיקה. אחסנו את תערובת המאסטר של המיקרוספירות בטמפרטורה של 4°C בחושך. ניתן לאחסן תערובת זו למשך חודשים אם היא נשמרת בתנאים אלו. ייצרו תוצרי PCR עבור כל דגימה.

הוסיפו את סט הפריימרים של הקצה הפ이브 פריים המודגמים בפוספילאט וביוטין מיד לאחר סיום ה-PCR. הוסיפו שני מיקרוליטרים של T7 exonuclease לכל מבחנת PCR והדגירו בטמפרטורת החדר למשך 40 דקות. בתום דגירה זו, הוסיפו 12.5 מיקרוליטרים של 0.5 molar EDTA pH 8.0 לתערובת.

זה נותן סה"כ של כ-64.5 µL של תוצר PCR גדיל-חוטי. יש לערבב את תערובת ה-Resus Bend Microsphere master mix באמצעות פיפטה. העבר כמות מתאימה לשפופרת אפנדור.

סגרו את המבחנה באמצעות פקק ובצעו סוניקציה במכשיר סוניקציה בתוך אמבט מים למשך שתי דקות. העבירו 17 µL של תוצר PCR גדיל-שרשראות בודד לבארים המתאימות בלוחית 96 בארות בעלת פרופיל נמוך, והוסיפו לכל באר 33 µL מתערובת חרוזי הסוניקציה שהושעו.

כסי את הפלטה עם כיסוי סיליקון והקישי עליה. הכנסי בעדינות את הפלטה למכשיר הטרמוסייקלר (thermocycler) עם תוכנית של 95 °C למשך חמש דקות, 60 °C למשך 10 דקות, השהייה ב-60 °C או הפסקה ב-60 °C למשך חמש דקות. סיום, הפעילי את התוכנית.

הכן תמיסת strep Aden FICO Ethin טרייה. יידרשו 25 µL לכל באר. הכן את ה-strep וה-FICO ethin על ידי דילול המגוף בריכוז של 1 mg/mL.

ריכוז של 50 עד 20 מיקרוגרם למיליליטר בתוך תמיפת tmac buffer בריכוז פי 1. כאשר ה-Thermocycler מגיע לשלב ההחזקה ב-60 degrees, פתח את המכסה, הסר את כיסוי הסיליקון והוסף תמיסת strep din FICO ethin ישירות לכל באער. החזר את כיסוי הסיליקון, סגור את מכסה ה-thermocycler והמשך בתוכנית.

עם סיום התוכנית, הוציאו את הפלטה והעבירו אותה במהירות למכשיר ה-bio plex לקריאה. יש לקרוא את הפלטה בתוך 10 דקות. קראו את הפלטה בטמפרטורה של 60 degrees.

יש לוודא שמרכיבי ה-bio plex חוממו מראש לטמפרטורה זו. כאן מוצגים תוצאות צביעות גרם ופרופילי luminex תואמים של דגימות אורך ממטופל בודד בנקודת הזמן אפס. צביעת הגרם עקבית עם אבחנה קלינית של bv, ודבר זה מאושש על ידי בדיקת Fiveplex Luminex המראה אותות היברידיזציה חיוביים לאורגניזמים הקשורים ל-BV, כולל Gardner Relic, vais ו-Apoian Vae.

גם *Lactobacillus iners* מזוהה ברמות נמוכות עם התקדמות הזמן. אצל נבדקת זו חל מעבר ממיקרוביוטה של BV למיקרוביוטה נורמלית, כפי שמעידים צביעות גראם. ניתוח Luminex של אותן דגימות מראה כי שכיחות ה-*Gardnerella vaginalis* מגיעה לשיאה ואז פוחתת, בעוד ש-*Lactobacillus iners* עולה עד להפיכתו לאורגניזם הדומיננטי בנקודת הזמן הסופית.

בשימוש בשיטה זו לאפיון המיקרוביוטה, המידע הנוצר מתבסס על נוכחותם של אורגניזמים ספציפיים וכן על השכיחות שלהם. מאחר שהשיטה מבוססת על רצף, ניתן לתכנן את הגושים (probes) בהסתמך על אנליזת רצף עמוק (deep sequencing), ואורגניזמים שזוהו בשיטות ריצוף מהדור הבא (next generation Sequencing) ניתנים למעקב בדגימות באופן מהיר ובעלות נמוכה יחסית. צפייה בסרטון זה אמורה הייתה להעניק לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן להפיק פרופיל מיקרוביאלי מדגימה באמצעות מכשיר Luminex או Bio Plex.

הדגמנו כיצד להצמיד גששים של אוליגנוקלאוטידים לחרוצים פלואורסצנטיים, להפיק אלקונים (alicons) בעלי גדיל בודד מדגימה קלינית או סביבתית, לבצע היברידיזציה ולקבוע את התוצאות באמצעות מכשיר Luminex או Bio Plex. בהצלחה בניסוייכם.