זיהוי של חיידקים באמצעות DNAzymes Fluorogenic

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא לזהות במהירות נוכחות של חיידקים ספציפיים כגון e coli באמצעות גשושי flu genic, DNA, Zyme חדשניים. ראשית, גשושי genic DNA. Zyme נוצרים על ידי ליגציה. לאחר מכן, החיידקים תורגבו כדי להעשיר את מספר מולקולות המטרה, ומתוך הנוזל העליון מוכנה תערובת חוץ-תאית מצברת.

לאחר מכן, מערבבים את תערובת החומרים הגולמית החוץ-תאית עם גשושית ה-DNA zyme. האינטראקציה בין גשושית ה-DNA Zyme לבין מולקולות המטרה גורמת לשבירה של הגשושית, אשר לאחר מכן פולטת פלואורסצנציה. האינטראקציה בין הגשושית למטרה נמדדת באמצעות פלואורימטר כעלייה בפלואורסצנציה היחסית. התוצאות מאומתות לאחר מכן באמצעות אנליזה של אלקטרופורזה בג'ל פוליאקרילאמיד דנטורי.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות PCR או שיטות המבוססות על נוגדנים הוא שההליך פשוט יותר וקל יותר לביצוע. למרות ששיטה זו פותחה עם החיידק המודל *e coli*, ניתן ליישמה לזיהוי של כל פתוגן חיידקי אחר המועבר במזון או בבתי חולים. באופן כללי, אנשים שאינם מכירים את השיטה עשויים להתקשות בביצועה, כיוון שייתכן שאינם רגילים לטיפול במ probes של DNA סינתטי ובחיידקים. את הפרוטוקול מדגימים Sergio Aguire, עוזר מחקר מהמעבדה שלי, ו-Monso Ali, עמית פוסט-דוקטורט.

R-F-D-E-C one הוא ה-DNA Zyme המוצג. הוא מורכב מהרצף הקטליטי EC one המסומן בקו שחור ומרצף הסובסטרט FS one המסומן בקו ירוק; בתוך הסובסטרט נמצא קשר RNA המסומן ב-r הכחול, המהווה מסגרת ל-DT המסומן ב-F המזוהה עם פלואור (Fluor) ול-DT המסומן ב-queue המזוהה עם מחמד (QUENCHER). RF SS one הוא גרסה מעורבבת (scrambled) של RFD EEC one, שבה הרצף הקטליטי EEC one מעורבב חלקית לתוך SS one, אך חלק ה-FS one נותר ללא שינוי. RF DEC one ו-RF SS one מיוצרים על ידי ליגציה אנזימטית מתווכת-תבנית של האוליגוניוקלאוטיד FS one עם האוליגוניוקלאוטיד EC one או SS one בנוכחות LT one כתבנית הליגציה, כדי להכין תערובות חוץ-תאיות גולמיות (crude extracellular mixtures או cems) שישמשו כמטרה עבור R-F-D-E-C one. התחילו על ידי חלוקה של 2 mL של LB לתוך מבחנות תרבית סטריליות של 14 mL באמצעות פפיט גאן (pipette gun).

בשלב הבא, בעזרת טיפ פלסטי סטרילי, קחו מושבה בודדת של e coli מתוך צלחת עם שכבת אגר וגלסלו אותה לתוך מבחנה המכילה lb. הניחו את המבחנות באינקובטור המכוון ל-37 °C ונערו ב-250 RPM למשך 14 שעות לאחר ההדגרה. כדי להפיק תרבית עם חיסון של 1%, העבירו 2 mL של LB טרי למבחנות תרבית בנפח 14 mL והוסיפו 20 µL מתרבית החיידקים מהשלב הקודם.

דגרו את המבחנות בטמפרטורה של 37 °C עם ניעור במהירות של 250 RPM עד שכל תמיסת חיידקים תגיע ל-OD 600 של בערך אחת. העבירו 1 mL מכל תרבית למבחנת מיקרו-צנטריפוגה חדשה בנפח של 1.5 mL ושקיעו את התאים על ידי צנטריפוגה ב-11,000 G למשך חמש דקות. לאחר הסבוב, העבירו את העלייה הצלולה למבחנת מיקרו-צנטריפוגה חדשה בנפח של 1.5 mL.

שמור את העילאי בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס. אם הוא לא ישמש באופן מיידי כדי לקבוע האם נוצר אות פלואורסצנציה כתוצאה מאינטראקציה של אנזימי ה-DNA עם תמצית התאים הגולמית, הדגימות ייבדקו באמצעות ספקטרופוטומטריה. הפעל את הספקטרופוטומטר הפלואורסצנטי והגדר את פרמטרי רכישת הנתונים עם עירור ב-488 ננומטר ופליטה ב-520 ננומטר.

כמו כן, הגדירו את המכשיר לקחת קריאות בכל דקה למשך שעה אחת. שטפו שלוש קובטות קריסטל קוורץ תחילה במים מזוקקים ודה-יוניים ולאחר מכן ב-100% ethanol. ייבשו את הקובטות באמצעות נשיפת גז חנקן.

סמנו את הקובטות כ-C one עבור ביקורת אחת, C two עבור ביקורת שתיים ו-T עבור הדגימה. לאחר מכן, העבירו 24 µL של מים מזוקקים ודה-יוניזים ל-C one, ו-24 µL של תערובת הגולמית החוץ-תאית של e coli שהוכנה ל-C two ול-T. הוסיפו 25 µL של 2X RB לכל קובטה והניחו אותן בספקטרופוטומטר פלואורסצנטי. התחילו באיסוף נתוני פלואורסצנציה, ולאחר חמש דקות, הוסיפו 1 µL של RFS S one בריכוז 5 µM ל-C two ו-1 µL של RFD eec one בריכוז 5 µM ל-T ול-C one, תוך הבטחה שקריאות הפלואורסצנצנציה אינן נקטעות. ערבבו כל תמיסה באמצעות פיפטינג, ולאחר מכן אפשרו לתגובה להימשך למשך שאר תקופת הרכישה.

שמרו את הנתונים בפורמט קובץ Excel. לאחר מכן, העבירו את הנתונים למחשב אישי והשתמשו ב-Excel כדי ליצור תמונה גרפית. אותן תערובות תגובה ששימשו לאנליזה באמצעות Spectra.

ניתן להשתמש בפוטומטריה לצורך אנליזה באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל. לאחר שעה של רכישת נתונים, הוציאו את הקובטות מהספקטרופוטומטר והעבירו את התמיסות למבחנות מיקרו-צנטריפוגה חדשות.

עצרו את התגובות על ידי הוספת 5 µL של נתרן אצטט בריכוז 3 M ו-125 µL של ethanol 100%. ערבבו כל תמיסה באמצעות וורטקס והניחו את המבחנות במקפיא בטמפרטורה של 20°C- למשך שעה אחת. לאחר הדגירה, סובבו את תערובות התגובה בצנטריפוגה ב-11,000 G למשך 20 דקות בטמפרטורה של 4°C, והסירו בזהירות את הנוזל העליון באמצעות פיפטה.

ייבשו את המשקעים באמצעות מלהיב DNA (DNA concentrator) למשך 10 דקות. הוסיפו 20 µL של בופר טעינה לג'ל וערבבו קצרה בעזרת וורטקס. סובבו קצר במערבל צנטריפוגה שולחני.

לאחר מכן, טען 10 µL מדגימות התגובה לכל באר בג'ל 10% Dage לאחר ההרצה. הסר את לוחות הזכוכית ושטוף אותם ביסודיות במי ברז. כדי להסיר שאריות ג'ל, נגב את הלוחות בעזרת נייר Kimwipe.

סרוק את לוח הג'ל כדי לזהות פלואורסצנציה באמצעות סורק typhoon. נתח את התמונות המתקבלות באמצעות תוכנת image quant כדי להעריך את רגישות המערכת. תרביות שדוללו בסדרה גודלו למשכי זמן הולכים וגוברים.

כדי לקבוע את תקופת הדגירה המינימלית הנדרשת לזיהוי חיידק בודד, הכינו 10 מבחנות תרבית המכילות 2 mL של lb. זרקו לכל תרבית 100 µL ממלאי גליצרין של e coli בריכוז של 2 CFU למילליטר, והדגירו בטמפרטורה של 37 °C עם ניעור במהירות של 250 RPM למשך 4, 8, 12, 16 ו-24 שעות. אספו 300 µL מכל אחת ממבחנות התרבית המזורקות, שכן ייתכן שלא יזוהו חיידקים בדגימות שנאספו בנקודות הזמן 4, 8 ו-12 שעות.

אפשרו לתרבית הנותרת לגדול במשך 24 שעות כדי לזהות תרביות המכילות חיידקים. מדדו את ה-OD 600 ושקעו את התאים על ידי סנטריפוגה ב-11,000 G למשך חמש דקות. העבירו את העילוי המכיל את ה-CEMS לשפופרות מיקרו-סנטריפוגה חדשות בנפח 1.5 מיליליטר, ואחסנו בטמפרטורה של 20- מעלות צלזיוס עד לשימוש למחרת.

בדקו את התרביות לבדיקת צמיחה. רק אחת או שתיים מתוך 10 התרביות עשויות להכיל e coli לאחר ההזרקה, והשפופרות הנותרות לא יכילו תאים. השתמשו ב-CEMS שהופקו מתרביות חיוביות בנקודות הזמן שנקבעו כדי להכין תגובות פיסול עם RFD EEC one, ונתחו את תערובות התגובה באמצעות אלקטרופורזה של ג'ל DAGE כפי שתיארנו קודם לכן; שני הגששים, RFD EEC one ו-RF SS one, הוכנו על ידי ליגציה אנזימטית של חלקי ה-DNA zyme לסובסטרט.

לאחר מכן נבחנה באמצעות ספקטרומטריה האינטראקציה של CEM EEC עם RFD EEC one או RF SS one. כפי שניתן לראות כאן, R-F-D-E-C one הפיק אות פלורסצנציה גבוה עם הוספת CEM ec.

בניגוד גמור לכך, R FS S one לא הפיקה אות פלואורסצנציה חזק. לפיכך, תפקוד ייצור הפלואורסצנציה של RFD EEC one. עם מגע עם CEM EC מתבצעת רצף.

כדי לוודא שהעלייה שנצפתה בפלואורסצנציה נבעה מפירוק קישור ה-RNA, תערובות התגובה נותחו על ידי פירוק של RFD eec; פירוק באמצעות sodium hydroxide בריכוז 0.25 molar צפוי להניב מקטעי RNA, מקטע 'חמיש-פריים' השומר על הפלואור ומקטע 'שלוש-פריים' השומר על המעכב (quencher). כפי שניתן לראות כאן.

תערובת התגובה של RFD EEC CEM EEC אכן הפיקה את תוצר הניתוק הצפוי. יתרה מכך, רק UNC ניתק את R-F-D-E-C one, ואת הפרגמנט של הקצה חמיש-הפריים ניתן היה לזהות באמצעות דימיון פלואורסצנטי. כדי לבחון את הספציפיות של RFD EEC one, בוצעו בדיקות פלואורסצנציה תוך שימוש ב-CEMS שנאספו מחיידקים גרם-שליליים וגרם-חיוביים אחרים בלבד.

הדגימה המכילה CEM EC גרמה לעלייה בפלואורסצנציה. היעדר תגובה צולבת עם CEMS מחיידקים אחרים מעיד על כך ש-R-F-D-E-C one סלקטיבי מאוד ל-e coli. כדי לקבוע את זמן התרבית המינימלי הדרוש לזיהוי תא e coli בודד, דללו e coli ל-1 CFU למיליליטר ב-100 µL שגודלו במצע גידול למשך 4, 8, 12, 16 ו-24 שעות. ה-CEMS שהתקבלו עורבבו עם R-F-D-E-C one, והשסע נבדק באמצעות dage כפי שמוצג כאן.

תמונה של בדיקת Dage מעידה כי R-F-D-E-C one לא הפיקה את תוצר הפילוח הצפוי. כאשר הגיב עם CEM, נדגמי ECS שנאספו לאחר ארבע ושמונה שעות של גידול מעידים כי נדרש זמן תרבית של 12 שעות לאחר השליטה בתהליך.

מרכיב המפתח בטכניקה זו הוא שניתן לבצע את הבדיקה המבוססת על אנזים DNAase תוך 60 דקות, אם היא מבוצעת כראוי לאחר פיתוח זה. ההליך סלל את הדרך עבור חוקרים בתחום הביואנליזה לבחון אנזימי DNA אלוגניים לזיהוי של מגוון רחב של פתוגנים חיידקיים.