במקביל, צלחת תזרים לשכת ואת מעגל זרימה רציפה להערכת ובתאים אנדותל תחת מתח זרימה למינרית שאר

המטרה הכוללת של מאמר וידאו זה היא לתאר טכניקה להחשפת תאים נצמדים לתנאי זרימה למינרית ולהערכת התגובה למאמצי גזירה של נוזלים הניתנים לכימות מדויק. דבר זה מושג תחילה על ידי הרכבת מעגל הזרימה ללא תא הזרימה. המעגל כולל מאגר דופק, משכך, צינורות קשיחים, צינורות גמישים, ברזי מעבר ארבע-דרכיים ומתאמי luer מחוברים, וכן מסנן אוויר.

השלב הבא הוא מילוי המעגל בנוזל הרצוי, כגון מצע גידול תאים בתנאים סטריליים, ולאחר מכן הפעלת המשאבה כדי למלא את משכך הדופקים (pulse dampener) ולנקות את הצינורות מאוויר. לאחר מכן, יש להחדיר את השקופית שבה מונחים התאים לתוך הלוח התחתון של תא הזרימה. השלב האחרון של הפרוטוקול הוא ההרכבה המלאה של מעגל הזרימה כאשר תא הזרימה מחובר למסלול.

בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות יישור של תאי אב אנדותליאליים מסומנים פלואורסצנטית תחת חשיפה למאמץ גזירה של נוזל דרך התא השקוף באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. כדי לחקור את ההתנהגות התפקודית של תאים, לעיתים קרובות יש צורך לחקות פיזיולוגיה in vivo על ידי חשיפת התאים למאמץ גזירה של נוזל. תכננו תא זרימה בעל לוחות מקבילים ומעגל זרימה רציף, המאפשרים לנו לחקור את התאים בתנאי זרימה ולצפות בהם דרך התא השקוף.

טכניקה זו יכולה לשמש ככלי מחקר בעל ערך עבור תחומי הרפואה וההנדסה. תא הזרימה שלנו מאפשר ויזואליזציה לסירוגין או בזמן אמת של תאים תחת זרימה, תוך שימוש במיקרוסקופ זקוף או הפוך. יתרה מכך, התכנון של ד"ר Nick מאפשר לחוקרים לדגום תמונות של תאים על פני שטח שקוף או רדיואופקי באמצעות עדשות מיקרוסקופ סטנדרטיות.

יתרה מכך, ניתן להשתמש בו ככלי חשוב במחקר פרמקולוגי לבדיקת השפעת תרופות על תאים בתנאי זרימה. ויזואליזציה של המערך היא קריטית מכיוון שחלק מהשלבים קשים לביצוע על בסיס קריאת פרוטוקול בלבד. אقدم הוראות שלב אחר שלב כיצד להקים את תא הזרימה ומעגל הזרימה הנפוצים במעבדה של Dr.Ock Next להרכבת מעגל הזרימה.

התחילו בחיבור קטע של 36 inch של צינור קשיח מקצה אחד של משכך פעימות לקצה השני. חברו קטע של 18 inch של צינור רך. מקמו מתאם lure זכר של one eighth inch בקצה של קטע הצינור הרך באורך 18 inch.

חבר את המחבר הזכר למתאם מחבר נקבה של שמינית אינץ'. חבר את המחבר הנקבה לקטע חדש של צינור רך באורך 18 אינץ'. קדח שלושה חורים במכסה של כלי זכוכית (beaker) בנפח 250 milliliter.

כדי להתאים את הצינורות, הכנס מקטע של 1.5 inch של צינור גמיש לאחד החורים כפתח לאוורור. הכנס את הקצוות החופשיים של הצינור הקשיח והצינור הגמיש דרך שני החורים האחרים בפקק אל תוך בקבוק זכוכית של 250 milliliter, שישמש כמיכל.

יש לוודא שהצינור הקשיח מגיע לתחתית המאגר. שמירה על סטריליות לאורך כל הרכבת המעגל היא קריטית להצלחת הפרוצדורה. לפיכך, יש לעקר את כל החלקים ועליך להשתמש בכפפות סטריליות לאורך כל התהליך.

בנוסף לחלקים שהורכבו, יש לעקר חלקים אלו. תא זרימה שלם אחד, מקטעים של 3X2 אינץ' של צינור גמיש, מתאם לוק (lure adapter) זכר אחד ונקבה אחת של 1/8 אינץ', ארבעה ברגי ראש שטוח של 1/2 אינץ', 6 ברגי ראש שטוח של 5/16 אינץ' עם 30 הברגות לאינץ', פינצטה אחת, זכוכית כיסוי אחת ושני מגבות שעוקרו בקיטור.

עיקור באוטוקלאב בטמפרטורה של 121 °C למשך 60 דקות. הנח את תא הזרימה של מעגל הזרימה, ארבעה ברזי עצירה ארבע-דרכיים, ברז עצירה חד-דרכי וכל החלקים המעוקרים על השדה הסטרילי. בעודך לובש כפפות סטריליות, חבר את שני ברזי העצירה הארבע-דרכיים.

יש להניח פקקים על פתחי הדגימה הפתוחים. נתקו את מתאמי החיבור הזכר והנקבה המחברים את שני מקטעי הפיתול הרך של מעגל הזרימה והכניסו את ברזי המעצור המחוברים. חברו את הפיתול הרך המוחדר למאגר למזרק של 30 milliliter והוציאו את בוכנת המזרק.

מלאו את הבקבוק ב-125 milliliters של מצע EPC. חברו מחדש את הפיתול הרך לברז העצירה. הכניסו מסנן מזרק סטרילי לפתח האוורור.

כעת העבירו את מעגל הזרימה לאינקובטור עם לחות בטמפרטורה של 37 °C ו-5% carbon dioxide. הצמידו את הצינור הקשיח לראש משאבת הגלילים מסוג master flex המיועד לשימוש עם סוג זה של צינור coal Palmer. ודאו שהצינור אינו חופף למסלולי ההרכבה של משאבת הגלילים.

סמנו בעזרת טוש את הצינורות בנקודות יציאתם מראש המשאבה משני הצדדים. לאחר שווידאתם שכל הברזי העצירה (stop cocks) סגורים לכיוון פתחי הדגימה ופתוחים לאורך מעגל הזרימה, הפעילו את המשאבה. ודאו את כיוון הזרימה.

על ה-PERFUSE eight לנוע ממאגר הזכוכית, דרך הפנימה הקשיחה, אל משכך הפולס (pulse dampener). להרכבת תא הזרימה, השתמש בכפפות סטריליות כדי לחבר מקטע צינור רך באורך שני אינץ' למתאם לור (lure adapter) נקבה של שמינית אינץ'. חבר מקטע צינור רך נוסף באורך שני אינץ' למתאם לור זכר של שמינית אינץ'.

חבר את צינור הגומי הרך באורך שני אינץ' עם מתאם Luer נקבה לפתח הכניסה ואת צינור הגומי הרך באורך שני אינץ' עם מתאם Lure זכר לפתח היציאה. חבר ברזי עצירה ארבע-דרכיים לשני מתאמי Lure אלו. חבר את קטע צינור הגומי הרך שנותר למחבר יציאת הצד של מלכודת הבועות וחבר ברז עצירה חד-כיווני באמצעות פינצטה סטרילית.

הוצא את השקופית שעליה זרעו את התאים מכלי תרבית התאים והנח אותה בתוך השקע שבפלטה התחתונה של תא הזרימה. ודא שהשקופית מונחת כאשר הצד שעליו נמצאים התאים פונה כלפי מעלה; בעזרת מזרק או פיפט, הוסף 10 milliliters של מצע EPC חמים על השקופית עם התאים. אפשר למצע לכסות את השקופית בתוך תא הזרימה, אך הקפד לא לשפוך את המצע על טבעת ה-O-ring שבפלטה התחתונה.

הניחו את הפלטה העליונה של תא הזרימה על הפלטה התחתונה, תוך התאמה של חורי הברגים. שמרו על שתי הפלטות במצב מקבילי כדי למנוע כניסת בועות אוויר לתוך הפלטות של ברגי התא. הדקו אותן יחד. בעזרת מברגה אוטומטית המופעלת על ידי סוללה, נקו את מלכודת בועות הכניסה מאוויר על ידי פתיחת ברז הסטופ-קוק החד-כיווני המחובר לפתח מלכודת בועות צד הכניסה.

השתמש במזרק של 10 milliliter כדי לשטוף בעדינות את צינור הכניסה עם תווך EPC, ולאחר מכן סגור ברז מעבר זה וחסום אותו בפקק. כעת, הוצא את האוויר מתעל התא על ידי פתיחת ברז המעבר הארבע-דרכי של יציאת הזרימה ושטיפה עדינה של תווך EPC דרך תא הזרימה. שוב, באמצעות מזרק של 10 milliliter, חסום בפקקים את כל החיבורים של ברזי המעבר הארבע-דרכיים וסגור אותם.

העבירו את תא הזרימה אל האינקובטור הלח עם מעגל הזרימה המורכב. עצרו את משאבת מעגל הזרימה וסגרו את ברזי העצירה (stop cocks) בכיוון הזרימה כדי למנוע דליפה.

חברו את תא הזרימה למעגל הזרימה. לאחר שחיברתם את תא הזרימה למעגל הזרימה, פתחו את ברזי המעצור בכיוון הזרימה. הפעילו שוב את משאבת הזרימה וודאו שה-PERFUSE eight זורם בכיוון הנכון. כווןנו את קצב הזרימה למאמץ הגזירה הרצוי.

במהלך ניסוי הזרימה, ניתן להוציא את תא הזרימה מהמעגל כדי לדמות את התאים באמצעות מיקרוסקופיה של אור או פלואורסצנציה. כדי לעשות זאת, נתקו את תא הזרימה ממעגל הזרימה בחיבורי הברזים (stop cock). כדי לאסוף דגימות פרפוזיה לצורך אנליזה.

ראשית, עצרו את המשאבה וסגרו את ברז המעצור הנמצא קרוב ביותר למשכך הדופקים. הסירו את מכסה ההגנה שלו והניחו אותו הפוך כדי להבטיח שלא יזוהם. הכניסו מזרק קטן לתוך פתח הדגימה.

סגרו את הברז לכיוון תא הזרימה, תוך השארת פתח הדגימה והמעגל לכיוון משכך הפולסים פתוחים. שאבו את כמות הדגימה הרצויה מהמעגל, וסגרו את הברז לכיוון פתח הדגימה לפני הוצאת המזרק. שמרו את דגימת ה-profuse eight בבקבוקון מסומן והקפיאו בטמפרטורה של minus 80 °C.

סגרו את פתח הדגימה וודאו שכל הברזים פתוחים לפני תחילת הזרימה. באמצעות שיטה זו, ניתן לזרוע תאי EPC (תאי דם מקדימים אנדותליאליים) ממקור דם אנושי על שקופיות טיטניום בתוך 15 דקות, והם נצמדים תחת כוחות גזירה פיזיולוגיים. כפי שמוצג באיור זה, תאי EPC התפשטו תחת השפעת הזרימה מכ-210 square microns מיד לאחר הזריעה, לכ-657 square microns לאחר שלוש שעות, ולכ-1,152 square microns לאחר 48 שעות של מאמץ גזירה נוזלי של 15 dines per square centimeter.

תמונה זו במיקרוסקופ אור Illustrating את האוריינטציה האקראית של תאי EPC אנושיים. לאחר תקופת התיישבות סטטית של שש שעות בעקבות שלוש שעות של זרימה ב-100 dines לסנטימטר רבוע, התאים התפשטו אך נותרו באוריינטציה אקראית. לאחר 48 שעות של מאמץ גזירה של נוזל ב-100 dines לסנטימטר רבוע, תאי ה-EPC מסודרים ומכוונים לכיוון הזרימה.

כאן, תאי EPCים סומנו ב-CTO וגרעיני התאים נצבעו ב-herx כדי למות לאחר הזרימה. להשוואה, תמונה זו מציגה תאי EPCים של חזיר על שקופיות טיטניום בקו אחד עם כיוון הזרימה. לאחר 48 שעות של זרימה וחשיפה למאמץ גזירה של 15 dines לסמ"ק, גבולות התאים נצבעו בצביעת anti pcam והגרעינים בצביעת חומצה גרעינית של cytoxin.

שיטה זו מאפשרת גם השגת דגימות מה-PERFUSE eight בנקודות זמן שנקבעו מראש לצורך ניתוח ו/או כימות של מטבוליטים תאיים מופרשים. מוצג כאן דוגמה לייצור ניטריט במהלך ניסוי זרימה של 48 שעות עם EPCs של חזיר. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לשמור על סטריליות לאורך כל התהליך.

בנוסף, חשוב לנקוט בצעדים הדרושים כדי להפחית את מספר בועות האוויר בתא הזרימה לפני תחילת הזרימה הרציפה, שכן הן עלולות לקלוף את התאים. אנו ממליצים גם לבדוק כל חיבור בתוך תא הזרימה ובמעגל לפני הפרופוזיה (profusion) כדי למנוע דליפה של PERFUSE eight במהלך הניסוי. תא זה תוכנן עם טבעות O-ring מובנות המאפשרות התאמה מלאה בין הפלטות העליונה והתחתונה ומספקות איטום אטום ללא צורך במשאבות ואקום.

תכונה זו מבטיחה גם גובה תא קבוע בין ניסויים ומבטלת את הצורך באטמי גומי או בהתאמות. תא הזרימה שלנו עושה שימוש בלומיות מיקרוסקופ סטנדרטיות. לכן, מספר גדול של תאים זמין לניסויים נוספים.

לדוגמה, ניתן להעריך RNA ו-DNA מתאים לאחר זרימה כדי לבחון סינתזה של חלבונים או ביטוי גנים. תכנון המעגל שלנו מאפשר איסוף של שמונה דגימות פרפוזיה לצורך ניתוח וכימות של מטבוליטים תאיים כגון nitrite, מטבוליט חמצוני ראשוני של nitric oxide, המופרש על ידי תאים תחת מאמץ גזירה של נוזל (fluid shear stress). לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן הרכבת תא הזרימה ומעגל הזרימה הסטרילי שלנו כדי להעביד תאים נצמדים תחת מאמץ גזירה של נוזל.