ויזואליזציה של Caenorhabditis elegans לציפורן מבנים באמצעות דיי ויטל lipophilic, DiI

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להדגים את הקוטיקולה בנמטודות חיים שקופות מסוג sea elegance באמצעות הצבע הליפופילי הפלואורסצנטי האדום dye eye. דבר זה מושג על ידי הכנת אוכלוסייה של נמטודות לצביעה. לאחר מכן, מתווסף dye eye מדולל לאוכלוסייה והם נשארים לדגירה.

לאחר מכן מוציאים את בעלי החיים מתמיסת הצביעה. הדמיה פלואורסצנטית של הקוטיקולה שנצבעה ב-Dai מראה פרטים על פני השטח, כולל מבנים רבייתיים של Ailey ו-Ann ומאפיינים מורפולוגיים חיצוניים אחרים. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות להדמיית קוטיקולה באורגניזם שקוף זה, כגון הדמיה ישירה, פלואורסצנציה, ביטוי טרנסגן, צביעה בנוגדנים, מיקרוסקופיה אלקטרונית ו-wheat germ agglutinin מסומן, הוא שביצוע הטכניקה פשוט, מהיר יחסית וזול, והיא מניבה רזולוציה מרשימה של מבני הקוטיקולה בבעלי חיים חיים.

שיטה זו יכולה לסייע במתן תשובה לשאלות מפתח בתחומים רבים המשתמשים במודל של sea elegance ובקוטיקולה שלו, כגון הפרשת תאים וארגון הקוטיקולה, התפתחות תאי אפידרמיס, מסלולי גנים הטרוכרוניים, חסינות מולדת, התפתחות תכונות מורפולוגיות ואבולוציה של נמטודות. את הפרוצדורה ידגים Robbie Schultz, סטודנט לתואר שני מהמעבדה שלי. בעבודה עם D Eye, יש לזכור כי הוא רגיש לאור.

הגנו תמיד את D eye מאור על ידי עטיפתו בנייר גביס. כמו כן, יש להשתמש בכפפות ובחלוק מעבדה מאחר ש-DMF הוא רעיל ו-DAI הוא car. Cyanide Dai הוא חזק מאוד.

דילול עבודה בריכוז סטנדרטי הוא 30 µg/mL של DII ב-M nine, ואוכלוסייה בודדת דורשת 400 µL בלבד של דילול העבודה. התחילו עם צלחת של 60 mm המאוכלסת בנמטודות שאינן מזוהמות. שטפו את בעלי החיים מהצלחת לתוך 1.5 mL של 0.5% Triton X 100.

בבופר M nine, סובבו בעדינות את הנוזל בתנועות סיבוביות כדי לשחרר את כל בעלי הגוף של הזחלים והבוגרים, ולאחר מכן העבירו את השטיפה לשפופרת של 1.5 מיליליטר. סובבו מיד את בעלי הגוף ב-2000 RRP M למשך 30 שניות כדי לרכז אותם בתחתית השפופרת. השליכו כמה שיותר מהנוזל העליון (supernatant) מבלי להפריע לבעלי הגוף.

היו זהירים והימנעו משימוש בכמות מופרזת. שטפו את בעלי החיים עם 1 mL של M nine. סבבו במ centri-fuge והסירו את העליון (supernatant).

חזור על השטיפה. סבב שוב במערך צנטריפוגה והסר את הנוזל העלון. לאחר מכן, הוסף למבחנה 400 µL של 30 µg/mL של Dai ב-M nine.

יש לערבל את המבחנה ב-Vortex למשך זמן קצר כדי להשעות מחדש את בעלי החיים. לאחר מכן, יש לנער את המבחנה בטמפרטורה של 20 °C במצב אופקי למשך שלוש עד 16 שעות במהירות של 350 RPM בסביבה מוגנת מאור. התזמון של השלבים האחרונים הללו הוא חשוב.

ראשית, יש לשטוף את ה-Triton X לפני שיסיר ליפידים שהצבע נקשר אליהם. שנית, יש להצבוע את בעלי החיים בתמיסת צבע למשך זמן מספיק כדי לאפשר צביעה אחידה של הקוטיקולה. לאחר מכן, יש לאפשר לבעלי החיים להתאושש על מזון למשך זמן מספיק כדי להסיר צבע שאינו קשור.

בסיום הצביעה, סובבו את בעלי החיים בצנטריפוגה להסמכה והסירו את תמיסת הצבע. שטפו את בעלי החיים ב-1 mL של M9. כדי להסיר צבע שאינו קשור, סובב את בעלי החיים בצנטריפוגה להסמכה והסירו את העלייה (supernatant).

שחזר את בעלי החיים ב-400 µL של באפר M9 ושפוך אותם על חלק נקי מחיידקים של מיקרו-פלטת NGM. לאחר זריעה של OP 50 E. coli, אפשר לבעלי החיים להתאושש בחושך למשך לפחות 30 דקות, אך לא יותר מיום אחד, מכיוון שפלואורסצנציית הצבע דוהה במהלך זמן ההתאוששות. בעלי החיים צריכים לזחול הרחק מהנוזל הצובע אל עבר המזון.

בעזרת בעלי חיים אלו קל יותר לבצע דימוי, שכן יש להם פחות פלואורסצנציית רקע מצבע חופשי בעין. התחילו בהכנת פד אגרי (agri pad) על שקופית. כדי להבטיח עובי אחיד של פד האגרי שבו משתמשים, השתמשו בשני סבבים (spacers).

הספייסר (spacer) מיוצר על ידי הנחת שתי שכבות של סרט הדבקה למעבדה על גבי פלטת זכוכית. ניתן להשתמש בספייסרים ללא הגבלה. לאחר מכן, הניחו פלטת זכוכית נקייה לאורכה בין שתי פלטות ספייסר, והעבירו בפיפט כ-150 µL של אגר מומס בריכוז 4%.

אל מרכז השקופית הזכוכית הנקייה. כסו במהירות את ה-AER הנוזלי באמצעות שקופית נוספת המונחת בניצב מעל ה-AER ושני המרווחים כדי ליצור פדי אגר. החליקו בזהירות את שקופית הכיסוי החוצה, תוך שמירה על הפד במרכז החלק העליון של שקופית ההרכבה.

כעת העבירו בפיפטה five µL של חומר הרדמה לנמטודות אל על הפד, מקמו 8 עד 12 בעלי חיים בתוך חומר ההרדמה וכסו בעדינות עם זכוכית כיסוי למיקרוסקופ. צפו בבעלי החיים באמצעות מיקרוסקופ אור או מיקרוסקופ קונפוקאלי המצויד בעדשה עם הגדלה של לפחות 40x ובמסנן TRITC או מסנן תואם אחר. שיא העירור הפלואורסצנטי של dye eye הוא 549 nm ושיא הפליטה שלו הוא 565 nm.

עבור הדמיה של צבע קשיר, זהו החלק המאתגר ביותר בפרוטוקול זה. אנו מראים כיצד לקבע את בעלי החיים להדמיה, אך עליכם לעבור הכשרה מתאימה על המיקרוסקופ הקונפוקאלי או המיקרוסקופ הפלואורסצנטי שבהם תשתמשו. מצאנו כי שימוש בעדשה עם הגדלה של לפחות 60x הוא המומלץ ביותר כדי להבחין בפרטים המוארים על ידי שיטת הצביעה.

כל אחת מהתמונות בסעיף זה צולמה באמצעות עדשה אובייקטיבית של 63 x ב-C. elegans עוברי פוסט-אמבריוני. פני השטח של הקוטיקולה מופרדים מדי פעם על ידי חריצים היקפיים ובשלבים מסוימים על ידי רכסים אורכיים הנקראים ailey. כל אחת מהתמונות בסעיף זה צולמה באמצעות עדשה אובייקטיבית של 63 x ב-C. elegans עוברי פוסט-אמבריוני.

פני השריון מכילים טבעות המופרדות על ידי חריצים היקפיים, ובשלבים מסוימים רכסים אורך הנקראים aley. לכל שלב התפתחותי ישנם מבני שריון בעלי הרכבים ותבניות מובחנים, רכסים או חריצים הן של aley והן של Aly, הצבו פלואורסנטית בהתאם להרכב הפני השטח.

במהלך כל שלבי הזחל והבוגר בשימוש בשיטת צביעה זו, הם נשארים גלויים למשך עד יום אחד לאחר השחרור. לעיתים נצפות נקודות פלואורסצנטיות ברקע, אך לא באופן שגרתי. זוהי הקוטיקולה של בעלי חיים בוגרים מוטנטיים המראים פגמים בינוניים בארגון הקוטיקולה.

רכבי איילי (Ailey ridges) הם אי-רציפים ועודפים. רכבי איילי הם מאוחדים ומסתעפים או דו-פיסוליים, סמן טרנסגני נפוץ. אלל דומיננטי של roll six גורם לפניסור של הקוטיקולה, שניתן לראות באיילי ועשוי לגרום לדפוס לא סדיר של הטבעות (annuli).

Dai צובעת גם מבני קוטיקולה חיצוניים אחרים, כולל את ההרמפרודיט הבוגר, הוולבה והזנב והמניפה של הזכר הבוגר; dai יכולה גם להדגיש פגמים עדינים במורפולוגיה חיצונית, כמו זנב מסועב זה, כתוצאה מstaining לא מספיק. לדוגמה, צביעה של שעתיים מובילה לצביעת קוטיקולה חלקית, אם כי נוירונים החשופים לסביבה עשויים להיצבע. ברגע שהטכניקה נשלטת, ניתן לבצעה בארבע שעות, לא כולל הדמיה, אם היא מבוצעת כה properly. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי אופן צביעת sea elegance באמצעות die eye לצורך תצפית על הקוטיקולה ומבנים מורפולוגיים חיצוניים אחרים.