הדמיית תאים חיים של חדירת הממברנה הליזוזומלית במהלך נקרופטוזיס

פרוטוקול זה מתאר שיטת הדמיה של תאים חיים למעקב אחר פרמאבוליזציה של ממברנה ליזוזומלית במהלך נקרופטוזיס באמצעות גלאי פלואורסצנטי שמזהים שינוי בשלמות הממברנה הליזוזומלית ובהחמצה. האתגר בתחום הוא לאפיין את הדינמיקה של האברונים שנפגעו במהלך תהליך מוות התאים, ולהגדיר במדויק כיצד נזק זה אמור להוביל או לתרום להשמדת התא. כדי להתחיל, לוחח 5,000 תאים בשני מיליליטרים של מדיה DMEM עם תוספת אנטיביוטיקה לתוך צלחת זכוכית סטרילית.

הניחו את הצלחת באינקובטור עם טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני, ודגרו את התאים במהלך הלילה. הוסיפו 20 מיקרוליטר של חרוזי דקסטרן ירוקים ל-25 מיקרוגרם למיליליטר במדיום DMEM טרי עם אנטיביוטיקה כדי לדלל אותם. הוציאו את המדיום הישן מהצלחת והחליפו בשני מיליליטרים של מדיום DMEM המכיל בשר בקר.

הניחו את המנה באינקובטור עם טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני, ודגרו במשך 24 שעות כדי לאפשר הפנמת חרוזים לליזוזומים. עכשיו הוסיפו שני מיקרוליטרים של תמיסת LysoTracker במלאי אחד לשני מיליליטרים של מדיה DMEM טרייה. החלף את המדיום הישן בתמיסת הכתמים הזו.

דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני למשך שעתיים. הפעל את רכיבי המערכת הקונפוקלית על ידי הפעלת המחשב האישי, מיקרוסקופ, כוח סורק, כוח לייזר, פליטת לייזר וכוח Leica. הפעל את בקרות הסביבה, כולל בקר הטמפרטורה שנקרא Cube, ובקר מערבל גז פחמן דו-חמצני, שנקרא Brick.

פתח את אספקת הפחמן הדו-חמצני והחמצן. כוון את בקר הטמפרטורה ל-37 מעלות צלזיוס. הגדר את בקר הגז והלחות ל-5% פחמן דו-חמצני ו-95% לחות.

הרכיבו את תא ההדמיה. לאחר הצביעה, שטפו את התאים שלוש פעמים עם שני מיליליטר של PBS, ואז הוסיפו שני מיליליטר של מדיום DMEM טרי. מרחו שמן טבילה על עדשת האובייקטיב לפני ההדמיה.

התקן את הצלחת על שלב המיקרוסקופ. כוון את עוצמת הלייזר ל-3% אך לא יותר מ-5% ואז כוון את הגיין בגלאי בתוכנת המיקרוסקופ כדי לייעל את האות. מזער את הרקע על ידי כיוון פס הניגודיות.

לרכוש תמונות בסיסיות של תאים לא מטופלים, המשמשים כתנאי בקרה. החזר את הפלטה למכסה הזרימה הלמינרי והוסיף אנטיביוטיקה מיליליטר אחת DMEM בתוספת מעודדי מוות תאי. בתוכנת הרכישה, הגדר את המצב ל-XYT, פורמט ל-512 על 512, מהירות ל-400, זום לשלוש, ממוצע קו לאחד, הצטברות קווים לשלוש, הצטברות פריימים לאחת, מרווח זמן לשלוש דקות, משך הזמן לשמונה שעות, והפעלת פוקוס אוטומטי.

לחץ על התחלה כדי להתחיל את רכישת הטיימלפס. הדמיה ראשונית אישרה נוכחות של פונקטות יציבות של LysoTracker ודקסטרן מסומן בפלואורסאין, מה שמעיד על ליזוזומים שלמים לפני הטיפול. ארבע שעות לאחר הטיפול ב-TSZ, הפלואורסצנציה של LyoTracker ירדה באופן ניכר, בעוד שהדקסטרן החל להראות פיזור ציטוזולי מפוזר, מה שמעיד על חדירות ראשונית לממברנת הליזוזומלית.

עד שמונה שעות לאחר הטיפול, האות של LysoTracker כמעט נעלם לחלוטין, בעוד שרבים מהתאים שמרו על פונקטות דקסטרן ירוקות עם אות ציטוזולי ירוק מפוזר. אנו מראים כי ניתן להמחיש ישירות את פרמאבוליזציה של ממברנת הליזוזום בתא חי העובר אינדוקציה נקרופטוטית. פרוטוקול זה מראה כי השילוב של חרוזי LysoTracker ו-dextran מאפשר ניטור בו-זמני של pH ליזוזומי ושחרור מטען בזמן אמת.

וחשוב לקידום פרוטוקול התמונה של תא חי זה הוא היכולת שלו לנטר שינוי pH קטן וחדירות ממברנה ליזוזומלית בזמן אמת, וללכוד אירועים דינמיים שחסרים בניתוח נקודות קצה כמו ציטומטריית זרימה וצביעת שכבה אחת.