שדה חשמלי מבוקר בימוי הגירה של ובתאים עצביות בסביבות 2 ד ו 3D

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להקליט את ההשפעה של שדות חשמליים מופעלים על הגירה של תאי אב עצביים בתרבית דו-ממדית (2D) ובמודלים תלת-ממדיים (3D) ex vivo. מטרה זו מושגת תחילה על ידי בידוד והרחבה של תאי אב עצביים in vitro. השלב השני הוא הכנת תרחיף של תאי אב עצביים בודדים.

בשלב הבא, להכנת תרבית דו-ממדית (2D), תאי מוצא עצביים נזרעים בתאי אלקטרוטקטיקה בעיצוב מותאם אישית. לחלופין, להכנת מודל תלת-ממדי (3D) ex vivo, תאי מוצא עצביים מסומנים באמצעות hooks 3, 3, 3, 4, 2, ומוחדרים למודל אורגנוטיפי של נתח חוט שדרה. לבסוף, שדה חשמלי מופעל על תאי האלקטרוטקטיקה ומתבצעת הקלטה של צילומי time-lapse כדי להראות כי תאי המוצא נודדים לעבר הקתודה של השדה החשמלי הן בסביבות דו-ממדיות והן בסביבות תלת-ממדיות.

היתרון המרכזי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת שיטה חדשנית למעקב חי אחר נדידה של תאים בודדים המושרה על ידי שדה חשמלי בעקבות השתלה למודל אורגנוטיפי תלת-ממדי, הדמה באופן הדוק את הסביבה הטבעית. שיטה זו יכולה לא רק לספק תובנות לגבי הטכניקה החשמלית, נדידה של תאי גזע עצביים שהושתלו לפלח של חוט השדרה, אלא יכולה להיות מיושמת גם במערכות אחרות כגון מודלים של פלחי מוח קטנים. כדי להתחיל בהליך זה, הכין רצועות זכוכית בגודל 22 על 11 מילימטר על ידי חלוקת רצועות בסטריליזציה (autoclave) בגודל 22 על 22 מילימטר.

חלקו לחצאיים כיסויים של זכוכית בעובי מספר 1 באמצעות עט יהלום. לאחר מכן, צרו באר זכוכית עצמאית עם מימדי פנים של 22 על 10 מילימטרים, על ידי הדבקה של ארבעה פסי זכוכית אנכיים במידות של 22 על 11 מילימטרים באמצעות גריז סיליקון לוואקום גבוה; המתינו שהבאר תתייבש ותתקשה לחלוטין במהלך הלילה. למחרת, הצמידו שני פסי זכוכית במידות של 22 על 11 מילימטרים במקביל זה לזה, תוך השארת רווח של 10 מילימטרים, לבסיס של צלחת תרבית של 100 מילימטרים באמצעות גריז סיליקון.

לאחר מכן, אטמו את האזור שבין הפסים הללו על ידי הצמדת זכוכית כיסוי בגודל 22 על 22 מילימטר באמצעות גריס סיליקון. הניחו את תא הזכוכית על זכוכית הכיסוי כך שדפנות הפנים ייצרו חלל סגור לזריעת התאים. אטמו את כל החיבורים למניעת חדירת מים באמצעות גריס סיליקון.

צפו את האזור המוגבל באופן עקבי ב-poly de lycine, ולאחר מכן בלמינין כפי שמתואר בכתב היד המצורף. בהליך זה, השגו מוחות מעכברים בשלבים E 14 עד E 16 והניחו אותם במצע בסיסי קר של D-M-E-M-F 12. לאחר מכן, הסירו את הקרומים תחת מיקרוסקופ אנטומי.

לאחר מכן, העבירו את המוחות לפיתרי (Petri dish) בקוטר 35 מילימטר. השתמשו בפינצטה עדינה כדי לפרק את המוחות למקטעי רקמה. לאחר מכן, העבירו אותם לשפופרת צנטריפוגה בנפח 15 מיליליטר.

סובבו את הדגימות במהירות של 800 RPM למשך שלוש דקות כדי להסיר פסדתיים D. לאחר מכן, הוסיפו לדגימות A-D-M-E-M-F 12 המכיל BFDF ו-DGF. ערבבו אותן בעזרת פיפטה של מיליליטר אחד.

לאחר מכן, השג תרחיף של תאים בודדים באמצעות מסננת תאים. זרע את התאים לבקבוקים בריכוז של 20,000 עד 50,000 תאים למילליטר. לאחר מכן, בצע החלפה מלאה של המצע מדי שלושה ימים, הכוללת סבב של התאים ב-1,300 RPM למשך חמש דקות.

שפשפו את הנוזל העליון, השעיקו את ה-PT במצע טרי, והחזירו את התאים לבקבוק בכל שישה ימים לאחר חמישה ימים לפחות. העבירו את ה-NEUROSPHERES למבחנה של 15 מיליליטר וסבבו בצנטריפוגה במהירות של 1,500 RPM למשך חמש דקות. שפשפו את הנוזל העליון.

שבי leyendo את המשקע ב-EDTA בנקיפות כדי להפיק תרחיף של תאים בודדים. לפני ביצוע ספירת תאים, הכין מיליליטר אחד של תרחיף המכיל 10,000 תאים. לאחר מכן, הסר את הלמינין מהבאר הזכוכית והנח לו להתייבש לחלוטין.

החליפו אותו ב-1 mL של תרחיף תאים. לאחר מכן, הניחו את הצלחת באינקובטור בטמפרטורה של 37 °C למשך ארבע שעות לפחות כדי לאפשר היצמדות. ברגע שהתאים הגיעו למספיק קונפלואנס (confluence), הסירו את המצע מהתא.

הסיר את הזכוכית בזהירות. לאחר מכן, צור גג מעל התאים על ידי הצמדה זהירה של כיסוי זכוכית (cover slip) במידות 22 על 22 מילימטר שעבר עיקור באוטוקלב, בין שני פסי זכוכית במידות 22 על 11 מילימטר, באמצעות גריז סיליקון. זכור לכסות את התאים בכמה טיפות של מצע גידול כדי למנוע התייבשות.

לאחר מכן, צרו מאגר מצע מבודד בכל קצה של התא על ידי יצירת שני מחסומי גריז סיליקון אטומים למים, המשתרעים מקצה אחד של הצלחת לשנייה. מלאו את התא במצע טרי, תוך הבטחת זרימה ממאגר מצע אחד לשני. לאחר מכן, החזירו את הצלחת לאינקובטור למשך 12 שעות כדי לאפשר התאוששות של התאים.

בשלב הבא, הכינו מכסה לכיסוי הצלחת על ידי קידוח שני חורים, כאשר כל אחד מהם ממוקם מעל מאגר אחד של תא הנדידה. לאחר מכן, החליפו את המצע בתא במצע תרבית המכיל 25 millimeter hippies buffer. לאחר מכן, העבירו את הצלחת למערכת הדמיה בעלת בקרת טמפרטורה.

הגדירו את הפרמטרים הניסיוניים להקלטה במרווחי זמן (time lapse) ובהרשמה ממיקומים מרובים. יישרו את התא כך שהקתודה והאנודה יהיו משמאל ומימין בהתאמה, כדי להבטיח שוקטור השדה החשמלי י przebהב אופקית כפי שנראה תחת המיקרוסקופ ומוקלט במערכת הדמיה. לאחר מכן, מלאו שני כוסי כימיה.

עם תמיסת שטיינברג (Steinberg). חברו כלי ביקר נפרד לכל מאגר מצע באמצעות גשרי זכוכית שהוכנו מראש ומולאו בתמיסת אגר של שטיינברג בריכוז 2%. לאחר מכן, הניחו את אלקטרודות הכסף המחוברות לספק כוח DC לתוך תמיסת שטיינברג.

בכל כלי כימי, כוון את חוגת המתח בספק הכוח לאפס והפעל אותו. מדוד את המתח על פני תא האלקטרו-טקטיק באמצעות מד מתח תוך כדי הגדלת המתח בחוגה. לאחר מכן, כוונן את המתח בהתאם לדרישות הניסוי.

לאחר מכן, התחילו את הקלטת ה-time-lapse. בצעו החלפת מצע וכווןו מחדש את המתח לפי הצורך. מדי שעה, ניתן להוסיף למאגרים מצע טרי, תרופות או חומרים כימיים בהתאם לדרישות.

השתמשו בחורים נוספים שנקדחו במכסה של צלחת הש qtd-culture, כאשר חור אחד ממוקם מעל כל מאגר מצע. בשלב זה, בצעו דיסקציה של חוט השדרה הזקיפ (lumbar spinal cords) מעכברים בני שבועיים. לאחר מכן, פרסו את חוט השדרה לפרוסות בעובי 500 micron באמצעות קוצץ רקמות machel wane תחת מיקרוסקופ אנטומי.

הפרידו את הפרוסות ובחרו את אלו בעלות מבנה שלחומה סגיטלי-אקסיאלי תקין. לאחר מכן, הניחו את הפרוסות בצלחת פטרי בקוטר 100 מילימטר המכילה 30 µL של ג'ל MA. מקמו אותן קרוב ככל האפשר למרכז.

שמור אותם באינקובטור עם 5% carbon dioxide בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 30 דקות לפחות. כדי שחלבוני ה-matrigel יעברו הרכבה עצמית וייצרו שכבה דקה המכסה את פני השטחים של נתחי חוט השדרה, חשוב מאוד שה-matrigel יורכב במלואו. במידת הצורך, דגרי את צלחת הפטרי בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך 30 דקות נוספות, ולאחר מכן הוסף ארבעה עד שישה מיליליטרים של מצע D-M-E-M-F 12 המכיל 25 millimolar heis buffer ו-15 עד 20% fetal calf serum.

בזהירות רבה, כדי למנוע זרימה ישירה של המצע על הפרוסות, ודאו שהפרוסות אינן שקועות לחלוטין במצע, כך שפני החתכים של החצילים יישארו חשופים היטב לאוויר. החליפו את המצע פעמיים בשבוע. כעת, דגרו את תרחיף תאי המוצא העצביים במצע עם חמישה µM hooks.

3, 3, 3, 4, 2 למשך 30 דקות. תחת מיקרוסקופ, השתמשו בצינור קפילרי מזכוכית כדי להזריק במיקרו 2 µL של התמיחה לתוך פרוסת חוט השדרה. ודאו באיטיות שצינור הזכוכית הקפילרי עובר דרך המטריג'ל ומגיע לחלקה הפנימי של פרוסת חוט השדרה.

השאירו את צינור הזכוכית בתוך פרוסתה של חוט השדרה למשך 30 שניות לפחות כדי למנוע התלייה של תאים. לאחר מכן, הכניסו את פטריית המעבדה המכילה את פרוסת חוט השדרה לאינקובטור בטמפרטורה של 37 °C עם 5 % פחמן דו-חמצני למשך הלילה. למחרת, בנו תא אלקטרוטקטי סביב פרוסת חוט השדרה המכיל ווים 3 3 3 4 2 המסומנים כתאי נוירוגנזה לפני הפעלת שדה חשמלי בעוצמה של 500 mV/mm.

כאן נראה כי תאי אב עצביים מפגינים נדידה מכוונת מאוד לעבר הקתודה כאשר הם חשופים לשדות חשמליים; קווים אדומים וחצים כחולים מייצגים את מסלולי הנדידה ואת כיוון תנועת התאים, בהתאמה. וכאן מוצג הגרף של מסלולי הנדידה. כאן מוצגים תאי אב עצביים המסומנים ב-hooks 3 3, 3, 4 2.

הם הושתלו בתוך פרוסה אורגנוטיפית של חוט השדרה בנקודת ההתחלה של הטיפול בשדה חשמלי. לאחר שתאי progenitor עצביים הגירה באופן מכוון לעבר הקתודה במשך 2.5 שעות, הופכה קוטביות השדה החשמלי. שינוי קוטביות השדה החשמלי עורר היפוך חד של צמיחת האקסונים לעבר הקתודה החדשה.

להלן תמונה של תאי פרוגניטור עצביים שהושתלו בתוך פרוסה של חוט השדרה. כאן מוצגים סוף ההקלטה של צילומי Time-lapse ושחזור תלת-ממדי של תאי הפרוגניטור העצביים שהושתלו בתוך פרוסת חוט השדרה. השליטה במסה הושלמה.

ניתן לבצע טכניקה זו תוך שבועיים אם היא מבוצעת כראוי לאחר פיתוחה. טכניקה זו סוללת כעת את הדרך עבור חוקרים בתחום הביולוגיה של התא לחקור את נדירתו של תאי פרוגניטורים עצביים במערכות תרבית דו-ממדיות (2D) ותלת-ממדיות (3D) בתגובה להחלה של שדה חשמלי.