זיהוי ישיר של פעילות Acetate יוצרי של קינאז Acetate אנזימים

ניסוי זה נועד למדידה ישירה של הפעילות ליצירת אצטט של אצטט קינאז. יש להתחיל את התגובה על ידי הוספת אנזים לתערובת תגובה המכילה אצטיל פוספט ומצעי DP. לאחר מכן, יש להוסיף הידרוקסילאמין הידרוכלוריד כדי להמיר את האצטיל פוספט שנותר לאצטיל הידרוקסילאט.

הוסיפו תמיסת פיתוח כדי להמיר את ה-acetyl hydroxylate לקומפלקס ferric hydroxylate צבעוני שניתן למדוד באופן ספקטרופוטומטרי. התוצאות, המבוססות על כמות מצע ה-acetyl phosphate שנצרך בתגובה, מאפשרות קביעה של פרמטרים קינטיים של האנזים. היתרון של טכניקה זו על פני שיטות קיימות הוא שהיא מבוססת על מדידה ישירה של צריכת acetyl phosphate, במקום צימוד של ייצור ATP להרדוקציה של ADP. מכיוון שבדיקה זו אינה מסתמכת על ייצור ATP, ניתן להשתמש בה עבור קבוצה חדשה של acetate kinases, המייצרות pyrophosphate במקום ATP. עבור עקום סטנדרט בן שש עד שמונה נקודות, דללו את תמיסת המקור של acetyl phosphate ב-100 millimolar tris לנפח דגימה סופי של 300 µL; כללו גם דגימת ביקורת ללא acetyl phosphate. השביחו את כל הדגימות בבלוק חימום בטמפרטורה של 37 °C למשך דקה אחת.

כעת, הוסיפו 50 µL של hydroxy lamine hydrochloride בריכוז 2 M, ערבבו על ידי ניעור שלוש פעמים והדגירו בבלוק חימום בטמפרטורה של 60 °C למשך חמש דקות. לאחר מכן, הוסיפו 100 µL של תמיסת פיתוח, ערבבו על ידי ניעור שלוש פעמים ואפשרו לצבע להתפתח למשך דקה אחת לפחות בטמפרטורת החדר. סבבו את הדגימות בצנטריפוגה באמצעות קיובטות פלסטיק עבור הספקטרופוטומטר.

מדדו את הדגימות באורך גל של 540 ננומטר. המשיכו ביצירת עקומת סטנדרט של בליעה ב-540 ננומטר אל מול מיקרו-מול של acetyl phosphate, תוך שימוש בתוכנה מתאימה לניתוח נתונים ולגרפים. חשבו את ערך ה-r squared.

חלקו מנות של 300 µL מתערובת התגובה לפראגות מיקרו-צנטריפוגה. זכרו לכלול תגובת בקרה ללא אנזים. השאיגו את הפראגות למשך דקה אחת בטמפרטורה של 37 °C. אם מבוצעות מספר תגובות, הוסיפו אנזים לפראגות במרווחי זמן ספציפיים והחזירו מיד כל פראגה לבלוק חימום של 37 °C.

לאחר חמש דקות, הוסיפו 50 µL של hydroxylamine hydrochloride בריכוז 2 M, ערבבו והדגרימו למשך חמש דקות ב-60 °C. לאחר מכן, הוסיפו 100 µL מתמיס הפיתוח, ערבבו והשאירו בטמפרטורת החדר לפיתוח הצבע. לאחר מכן, סובבו את הדגימות בצנטריפוגה במהירות של 18,000 ×g למשך דקה אחת.

המשיכו למדידת הבליעה באורך גל של 540 ננומטר. קבעו את כמות ה-acetyl phosphate הנוכחת באמצעות השוואה לעקומת הסטנדרט של acetyl phosphate. ניתן להשרטט את הנתונים ולהתאימם למשוואת McKayla Cementin לצורך קביעת פרמטרים קינטיים.

בדיקה זו קובעת את צריכת תסבסאט האצטיל פוספט כדי למדוד את פעילות האצטט קינאז בכיוון של יצירת אצטט. אצטיל פוספט שנותר לאחר זמן נתון במהלך התגובה האנזימטית הופך לאצטיל אוקסיבט ולאחר מכן לקומפלקס פריק הידרוקסי אט, בעל צבע אדמדם שניתן למדוד ב-540 ננומטר. לעקום סטנדרטי טיפוסי זה, המציג בליעה ב-540 ננומטר לעומת מיקרומול אצטיל פוספט, שיפוע של 1.2332 יחידות בליעה למיקרומול אצטיל פוספט.

ערך ה-r squared המתקבל, 0.99, מעיד על כך שהנתונים תואמים היטב למשוואה הליניארית כפי שמתואר כאן. ניתן להשתמש במבחן זה כדי לקבוע את ה-KM של acetyl phosphate עבור תכשירי אנזים שונים. בריכוז של 5 millimolar, עבור DP עם ריכוזים משתנים של acetyl phosphate, אנזים recombinant acetate kinase מטוהר מ-methanol Sarina thermophilic מראה קינטיקה סטנדרטית מסוג McKayla cementin עבור כל סובסטרט, מה שמוביל ל-KM נראה של 0.27 פלוס או מינוס 0.01 millimolar של acetyl phosphate.

בניגוד לבדיקה המצומדת הסטנדרטית, בדיקה ישירה זו יכולה למדוד את הפעילות של קינזות אצטט המשתמשות בסובסטראטים שאינם TP. לדוגמה, בניצול של אצטיל פוספט על ידי קינזת אצטט של *Entamoeba histolytica* המייצרת פירופוספט, פוספט נתרן הוחלף ב-DP בתערובת התגובה. העקומה שהתקבלה מעידה על ערך KM נראה של 0.50 פלוס או מינוס 0.006 millimolar של אצטיל פוספט. לאחר צפייה בסרטון זה, אמורה להיות לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן למדוד את פעילות קינזת האצטט באופן ישיר על ידי קביעת כמות אצטיל הפוספט שנצרכה.

גורם מרכזי להשגת תוצאות הדירות הוא עקביות בכל שלב, ובמיוחד בהוספת האנזים ובשלב הערבוב.