ויזואליזציה של כלי דם Ca ^{2 +} איתות מופעלות על ידי ROS נגזר אוטוקריני

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להדגים ויזואלית את השיגנלינג של סידן בכלי הדם המופעל על ידי רדיקלי חמצן (ROS) ממקור פריקריני. דבר זה מושג תחילה על ידי הדמיה של ROS באמצעות צבעים הרגישים לחמצון במקרופאגים פעילים. ניתן להדגים ROS גם בתאים אנדותליאליים באמצעות חיישנים פלואורסצנטיים מבוססי פלסמיד.

לאחר מכן, עברו לוויזואליזציה בו-זמנית של מקפגים מופעלים המסומנים ב-cell tracker red ותאי אנדותל המסומנים ב-flu of four במודל של תרבית משותפת. לבסוף, מדדו את איתות הסידן בתאי האנדותל שמופעל על ידי ROS שמקורם במקפגים, באמצעות מערכת דימוי קונפוקאלית.

תוצאות אלו יכולות להדגים את רמות ה-ROS באופן עצמאי, וכן להעריך בו-זמנית את גיוס הסידן התוך-תאי המופעל על ידי ROS הנגזר מ-Peregrine. שיטה זו מאפשרת הערכה סימולטנית של שני מולקולות איתות שונות המעוררות באופן הדוק איתות כלי דם ומצב פתופיזיולוגי של סימולטור. שני פוסט-דוקטורנטים מהמעבדה שלי, Karthik ו-Raj, ידגימו את הפרוצדורה על מדידות גולמיות ומדידות סידן, וכן על אינטראקציות בין מקרופאגים לתאי אנדותל.

תרבתו מקפגים גזורים ממונוציטים של עכברים בצלחות בעלות תחתית זכוכית בקוטר 35 מילימטר. לאחר מכן, חפו את התאים עם אגוניסטים של קולטן דמוי-טול (toll-like receptor) דגרו אותם למשך שש שעות בטמפרטורה של 37 °C. לצורך ויזואליזציה של הציטוזול.

להערכת ROS, הוסיפו צבע הרגיש לחמצון והדגירו את התאים למשך 20 דקות. כעת, הדמיאו את התאים על במה בבקרה טמפרטורלית של מערכת דימיון קונפוקלית. לחלופין, כדי להדגים ROS מיטוכונדריאלי בתאים שהופעלו באמצעות TLR, הוסיפו אינדיקטור לסופראוקסיד מיטוכונדריאלי והדגירו את התאים למשך 30 דקות ב-37 °C.

עבור ביקורת שלילית, טפל את התאים ב-PBS או ב-DMSO עבור ביקורת חיובית. טפל את התאים ב-2 mM antimycin. לאחר מכן, עבור להדמיה של כל התאים על במה עם בקרת טמפרטורה של מערכת דימיג קונפוקאלית.

באמצעות תוכנת Image J, נתחו את כל נתוני התמונה. החיישן הפלואורסצנטי hyper מזהה באופן ספציפי ריכוזים סוב-מיקרומולריים של פרוקסיד, ובהתבסס על ביטוי ביונקים, ניתן לכוון את תכנון הווקטור לציטופלזמה או למיטוכונדריה. באמצעות אלקטרופורציה, צרו קווים יציבים של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ריאתיים של עכבר הנושאים פלסמיד עם ביטוי-יתר של hyper.

כדי להקל על צמיחת מושבות, זרע תאים בצפיפות נמוכה ב-TMEM מלא והדגר למשך 48 שעות, לאחר מכן החלף את המצע במצע תרבית מלא בתוספת אנטיביוטיקה לברירה. סרוק את השיבוטים כדי למצוא את האחוז הגבוה ביותר של תאים היפר-חיוביים, והגבל את התרבית כדי ליצור קווים יציבים של תאים היפר-חיוביים עבור ניסויים בודדים. זרע תאים על כיסויות זכוכית מצופות ג'לטין בריכוז 0.2% והגדר למשך לילה עד להגעה ל-80% התלכדות.

כעת הפעילו את התאים באמצעות ליגנדים של TLR והדגירו למשך שש שעות ב-37 °C. לצורך זיהוי ROS ציטופלזמי, רכבו את כיסויי הזכוכית (cover slips) של התאים על תא תאים מסוג adelo. הוסיפו 1 mL של תמיסת מלח מאוזנת (balance salt solution) שחוממה מראש, והניחו את התא על במה עם בקרת טמפרטורה של מערכת ההדמיה הקונפוקלית.

יש להקליט שינויים בפלואורסצנציה בתאים לצורך זיהוי של ROS מיטוכונדריאלי. יש לכלול בקר חיובי של 2 µM antimycin A. לאחר מכן, יש להכין את לביות הזכוכית של התאים שעברו טיפול עבור מיקרוסקופיה קונפוקלית. בצע ניתוח תמונות באמצעות תוכנת Image J.

התחל עם תאי אנדותל שגודלו עד ל-80% confluence על כיסורי זכוכית מצופים בג'לטין, לצורך ויזואליזציה ומדידה של שינויים בריכוז הסידן התאי. דגור את התאים בצבע הפלואורסצנטי fluo-4 AM בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות; כדי למזער את איבוד הצבע, שטוף את התאים בתמיסת דימיג'ינג ניסויית המכילה suen pyro zone. כעת, הרכב את כיסורי הזכוכית על תא אדלו (adelo cell chamber) עם 800 µL של תמיסת דימיג'ינג ניסויית שחוממה מראש, ומקם את התאים על במה מבוקרת טמפרטורה של מערכת הדימיג'ינג הקונפוקלית בתוך מבחנה נפרדת.

השתמש ב-500 nanograms per milliliter של cell tracker red C-M-T-P-X למשך 15 דקות כדי לסמן את אוכלוסיית המקרופאגים הנחקרת; שטוף את התאים והשהה מחדש את המשקעים ב-200 microliters של תמיסת דימות ניסויית. כעת הוסף את המקרופאגים המסומנים על גבי תאי אנדותל הטעונים ב-flu oh 4:00 AM במכלול תא confocal. רשום את הפלואורסצנציה הירוקה והאדומה בכל שלוש שניות למשך 10 דקות.

בניסוי זה, תאי J 7 74 0.1 נחשפו לליגנדים של TLR שתיים, שלוש וארבע למשך שש שעות. תמונות קונפוקאליות מייצגות מראות עלייה ב-R os ציטוזולי כפי שנמדד באמצעות DCF. באופן מעניין, פלואורסצנציה אדומה של mitoses socks מעידה על עלייה דומה ב-ROS מיטוכונדריאלי.

שינויים פלואורסצנטיים אלו הם כמותיים. לפיכך, יש לנרמל את התוצאות ולהביעם כשינוי מכפלה יחסי לכל טיפול, כאשר אות ה-antimycin a מהווה בקרת חיובית לייצור ROS מיטוכונדריאלי. איור זה מציג תמונות של רמות פחמימן באנדותל, בציטוזול ובמיטוכונדריה בתאים המבטאים באופן יציב hyper cyto או hyper D mito.

MP ECS שעוררו באמצעות אגוניסטים של TLR. כימות של שינוי בממוצע הפלואורסצנציה מדגים עלייה בפלואורסצנציה של hyper cyto ו-hyper D mito לאחר שש שעות של עיבור במערכת של שיתוף-תרבית. כדי להעריך את סיגנל ה-ROS של Peregrine, מקרופאגים ממירין שבודדו באופן טרי הן מעכברים מסוג wild type והן מעכברים מסוג GP 91 Fox null הופעלו באמצעות 1 µg/mL של LPS למשך שש שעות.

מקרופגים סומנו בצבע אדום באמצעות C-M-T-P-X והוסיפו ל-MPM ecs טעונים בفلורסצנציה ירוקה. באופן מעניין, מקרופגים מופעילים על ידי LPS שבודדו מעכברי פרא (wild type) עוררו גיוס סידן נרחב ומהיר ב-MPM ECS בהשוואה למקרופגים מעכברי GP 91 Fox null.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי הן הורדה ממושכת והן חשיפה לייזר עלולות להוביל לחמצון עצמי של DCF. חיוני למנוע פוטו-בליצ'ינג (photo bleaching) של hyper cyto ו-hyper D mitral. לאחר רכישת מיומנות, ניתן לבצע מדידת RA במקרופאגים ובתאי אנדותל בתוך שבע שעות, בתנאי שהתהליך מבוצע כהלכה.