מסלול אישור דיסקברי מטבולית ודרך ¹³ C-תיוג של חומצות אמינו Proteinogenic

מטרתו של פרוטוקול זה היא לחקור מטבוליזם חיידקי באמצעות ניתוח מטבוליסטי מסייע של פחמן 13. ראשית, מיקרובים גודלים בנוכחות מצעי פחמן מסומנים, אשר נטמעים בחלבונים המיקרוביאליים. לאחר מכן, המיקרובים נאספים וחומצות האמינו מופקות, עוברות הידרוליזה ונגזרות.

הדגימות מוחדרות לכרומטוגרף גז ולספקטרומטר מסות, או GCMS. באמצעות מעקב אחר נתיבי מעבר האטומים בין מטבוליטים ברשת הביוכימית, ניתן לקבוע את המסלולים המטבוליים התפקודיים שבהם השתמש המיקרוב. אני ברט בורלה.

השיטה שאנו מציגים כאן יכולה לשמש כהשלמה לטרנסקריפטומיקה ופרוטאומיקה לצורך קביעת המסלולים המטבוליים במיקרובים. השתמשנו בטכניקה זו כדי לחקור מיקרובים פוטוסינתטיים כגון ציאנובקטריה לצורך ניצול פחמן מיוטרופי או הטרוטרופי. בסרטון זה, נשתמש ב-ANOTHE 5 1 1 42 כזן מודל כדי להדגים את השימוש בסובסטראטי פחמן מסומנים לגילוי תפקודים אנזימטיים חדשים.

את הפרוצדורה ידגימו אני, li Yu ו-Chu Yang Fang. התחילו את הפרוצדורה על ידי גידול חיידקי cyana thesei במצע שאינו מסומן. כאשר החיידקים מגיעים לשלב צמיחה לוגריתמי בינוני, חַפּוּ 3% מהנפח לתוך המצע המסומן ב-carbon 13.

לאחר מכן, כדי למנוע הכנסה של פחמן לא מסומן מתרבית ההזריעה הראשונית לאותו מצע מסומן בשלב צמיחת הלוג 중간 (middle log growth phase), כאשר חיידקי ה-Cy Thesei המסומנים ב-carbon 13 מגיעים לשלב צמיחת הלוג 중간, קצרו 10 milliliters באמצעות סנטריפוגציה. השביו מחדש את המשקע ב-1.5 milliliters של חומצה כלורית (hydrochloric acid) בריכוז six molar והעבירו אותו לבקבוק זכוכית שקוף עם מכסה הברגה המיועד לכרומטוגרפיה גזית (GC vial).

סגרו את הבקבוקונים והניחו אותם בתנור בטמפרטורה של 100 °C למשך 24 שעות כדי להידרוליז את חלבוני הביומסה לחומצות אמינו. הידרוליזה של כדורי ביומסה מניבה 16 מתוך 20 החומצות האמינו הנפוצות; לאחר ההידרוליזה, העבירו את תמיסת חומצות האמינו למבחנות מיקרו-צנטריפוגה של 2 mL ולאחר מכן ביצעו צנטריפוגה ב-20,000 G למשך חמש דקות. לאחר ההידרוליזה, העבירו את תמיסת חומצות האמינו למבחנות מיקרו-צנטריפוגה של 2 mL ולאחר מכן ביצעו צנטריפוגה ב-20,000 G למשך חמש דקות כדי להשקיע חלקיקים מוצקים.

לאחר הסבוב, העבירו את הנוזלים העליונים למבחנות GC חדשות כדי להסיר חלקיקים מוצקים מהתמיסה שעברה הידרוליזה, כדי שלא יחדרו לעמודת ה-GC. לאחר מכן, חומצות האמינו עוברות נגזרת כדי להפוך אותן לנדיפות לצורך הפרדה באמצעות כרומטוגרפיית גזים. המיסו את הדגימות המיובשות ב-150 µL של tetrahydrofuran (THF) וב-150 µL של N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide.

הדגרי את כל הדגימות עם ריאגנט נגזרת Acetamide, T-B-D-M-S בתנור בטמפרטורה של בין 65 ל-80 °C למשך שעה אחת. בצע ערבוב ב-Vortex לדגימות מדי פעם כדי להבטיח שהמטבוליטים בתוך הבקבוקון מומסים. סבב את הדגימות בצנטריפוגה ב-20,000 ×g למשך 10 דקות ולאחר מכן העבר את הנוזל העליון (supernatant) לבקבוקוני GC חדשים.

התוף (supernatant) צריך להיות תמיסה צהובה צלולה. טמפרטורות ה-GC הן כדלקמן: החזקה ב-150 degrees Celsius למשך שתי דקות. העלאה של three degrees Celsius לדקה עד ל-280 degrees Celsius.

העלה את הטמפרטורה בקצב של 20 degrees Celsius לדקה עד ל-300 degrees Celsius, ולאחר מכן החזק אותה למשך חמש דקות. לאחר מכן, עבור עמודת GC באורך 30 meter, הגדר את השהיית הממס (solvent delay) לכ-חמש דקות ואת טווח יחס המסה למטען (mass to charge ratio) בין 60 ל-500. נתח את הדגימות באמצעות GCMS בהזרקה של 1 microliter ביחס פיצול (split ratio) של 1:5 או 1:10, תוך שימוש בגז נשא helium בקצב של 1.2 milliliters לדקה בהתאם למהלך הריצה.

נתחו את נתוני ה-GCMS באמצעות Microsoft Excel. זמן השרירות ב-GC ופיקי יחס המסה למטען הייחודיים לכל חומצת אמינו מוצגים באיור זה. T-B-D-M-S. חומצות אמינו נגזרות מופרדות בדרך כלל בבירור על ידי MS לשני מקטעים טעונים: מקטע M פחות 57, המכיל את חומצת האמינו השלמה, ומקטע M פחות 159, שבו חסרה קבוצת האלפא-קרבוקסיל של חומצת האמינו עבור ליוצין ואיסוליוצין.

הפיסגא M מינוס 57 חפפה עם פיסגאות מסה אחרות של פרגמנטים. ניתן להשתמש ב-N מינוס 15 כדי לנתח את כל סימון חומצות האמינו. כמו כן, קבוצת F 3 0 2 מזוהה לעיתים קרובות ברוב חומצות האמינו, והיא מכילה רק את קבוצת האלפא-קרבוקסיל הראשונה ואת הפחמנים השניים בשלד חומצת האמינו.

עם זאת, מכיוון שלפסגה זו (Ms.Peak) יש לעיתים קרובות יחסי רעש לאות גבוהים, F 3 0 2 אינה מומלצת לניתוח כמותי של שטפי מטבוליים. נגזרות של חומצות אמינו או מטבוליטים מרכזיים מכניסות כמויות משמעותיות של איזוטופים מסומנים באופן טבעי, כולל carbon 13, oxygen 18, silicon 29 ו-silicon 30. ניתן לתקן את רעש המדידה מאיזוטופים טבעיים בספקטרום או באיזוטופ המסה הגולמי באמצעות תוכנה שפורסמה.

נתוני הסימון האיזוטופי הסופיים מדווחים כחלקי מסה. לדוגמה, M0, M1, M2, M3 ו-M4, המייצגים מקטעים המכילים מאפס עד ארבעה פחמנים מסומנים ב-carbon 13 ב-cyana. זן זה אינו מכיל את האנזים three anine ammonia lyase, המזרז את ההמרה של three anine ל-two keto butyrate במסלול הסינתזה הטיפוסי של isle.

לפיכך, כדי לפענח את מסלול ה-isle באורגניזם זה, *Cyana thesei* 5 1 1 42 גודל במצע ASP two עם 54 מילימולר גליצרין ונחקר באמצעות GC-MS כפי שמתואר בסרטון זה וכפי שמוצג כאן. *Cyana thesei* 5 1 1 4 2 משתמש בגליצרין המסומן בעמדה השנייה כמקור הפחמן העיקרי, והבחנו כי לתריאונין ולאלנין, שהם נגזרים של פירובט, יש פחמן מסומן אחד, בעוד שאיסולוצין סומן בשלושה פחמנים. לפיכך, הסינתזה ב-*Cyana thesei* 5 1 1 4 2 אינה יכולה להיגזר ממסלול התריאונין המשמש את מרבית האורגניזמים. מאידך, ללוצין ולאיסולוצין דפוסי סימון זהים בהתבסס על פרגמנט M-15 ופרגמנט M-159.

לדוגמה, האיזוטופ או הנתונים מ-N-15 המכילים חומצות אמינו שלא עברו פרגמנטציה הראו סימון זהה עבור ליוצין ו-ISO-ליוצין. לפיכך, ליוצין ו-ISO-ליוצין חייבים להיות מסונתזים מאותם חומרי מוצא, פירובט ואצטיל-CoA. תצפית זו עולה בקנה אחד עם מעבר הפחמן המסומן במסלול הציטרה-מאלט עבור סינתזת isle.

ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לחקור את המטבוליזם של מגוון רחב של מיקרובים, ולאחר רכישת המיומנות, ניתן לבצעה מההתחלה ועד לסיום בתוך כשבוע.