Live-תא הדמיה של תאים מעבר הבעת חלבונים fluorescently-מתויג מטריקס תלת מימדי

הדגמה זו נועדה לדמות חלבונים המסומנים פלואורסצנטית בתאים חיים בתוך מטריצה תלת-ממדית (3D). ראשית, ייצרו שורות תאים יציבות המבטאות חלבונים מסומנים פלואורסצנטית. זרעו תאים אלו לתוך מטריצת קולגן תלת-ממדית, ולאחר מכן רכשו תמונות Time-lapse של תאים נודדים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקאלי.

בסופו של דבר, התוצאות שופכות אור על לוקליזציה ודינמיקה של חלבונים בתוך תאים נודדים באמצעות דימותים של lapsed-time וניתוח FP, תוך התבוננות בדינמיקה ובלוקליזציה של חלבונים בתלת-ממד ובזמן אמת. גישה זו מציעה דרך אחת למענה על שאלות יסודיות בנוגע לנדידה של תאים. לדוגמה, כיצד מווסרות מגעים אדחסיביים על ידי חלבונים ציטופלזמיים?

וגם כיצד מגעים אלו מושפעים על ידי מעכבים ספציפיים. בצלחת P35, תרבלו תאים בדרגת התרבות (confluency) של 80% עד 90%, והעבירו את הפלסמיד הרלוונטי לתאים באמצעות Lipo 2000 בהתאם להוראות היצרן. לאחר מכן, הניחו את התאים באינקובטור.

ביום למחרת, חלק את התאים לשתי צלחוני פטרי P1 50 והדגר אותם למשך לילה. חדש את המצע כדי להוסיף 50 µg/mL של G418. המשך את התרבית תחת ברירה אנטיביוטית למשך שבועיים.

בדקו את התרבית לאיתור מושבות עמידות ל-G four 18. לאחר מכן, באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנציה הפוך, זהו וסמנו את המושבות החיוביות ל-GFP.

שטפו את התאים פעמיים ב-PBS. לאחר השטיפה השנייה, השאירו שכבה דקה של נוזל כדי למנוע מהתאים להתייבש בכל מושבה מסומנת. נגבו במידת האפשר קרוב ככל האפשר לשוליים באמצעות מקל צמר sterilized, וטפטפו 10 µL של trypsin על המושבה.

חזרו על הפעולה במהירות עבור כל מושבה. לאחר מכן, דגרו את הצלחת ב-37 °C כדי להשיג ניתוק של התאים. ודאו את המראה העגול תחת מיקרוסקופ.

הוסיפו 10 µL של trypsin לכל מושבה, ובצעו פיפטינג כדי לנתק לחלוטין את התאים מהצלחת. לאחר מכן, העבירו כל מושבת תאים לבאר בודדת בצלחת תרבית של 24 בארות כדי להגדיל מושבות יציבות. לאחר מכן, העריכו את ביטוי החלבון של המושבות באמצעות western blot סטנדרטי ואימונופלואורסצנציה.

הרחב את שינוי פני השטח של קווי תאים נבחרים על הזכוכית. מצע תחתון מספק קישור אופטימלי לקולגן. העבר בפיפטה 300 µL של תמיסת סילוניזציה על חלק הזכוכית של כל צלחת P 35 עם פתח של 10 mm.

דגרו למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. שאבו את התמיסה ושטפו במים מסוננים שלוש פעמים, למשך 10 דקות בכל פעם. הסירו את המים והניחו את הצלחות על פלטה מחוממת בטמפרטורה של 50 °C למשך 1.5 שעות.

הניחו את מכסי הצלחונות מעט בצורה לא אטומה כדי לאפשר ייבוש. לאחר שהצלחונות היבשים התקררו, טפטפו 300 µL של תמיסת glutaraldehyde בריכוז 2% על החלק הזכוכיתי של כל צלחון. דגרו למשך שעה אחת, ולאחר מכן שטפו עם PBS 3 פעמים למשך 10 דקות בכל פעם.

המשיכו בעיקור של הצלחונות באמצעות חשיפה לקרינת UV למשך שעה אחת. ראשית, השקיעו 100 µL של חלקיקי סמן פלואורסצנטיים באמצעות צנטריפוגה. השליכו את הנוזל והשעיקו מחדש את החלקיקים ב-500 µL של מצע גידול.

בצע חמישה שטיפות, ולאחר מכן השהה מחדש את החלקיקים ב-30 µL של מצע. לאחר מכן, אסוף את התאים המבטאים GFP באמצעות טריפסין והכן תרחיף של 2 מיליון תאים ל-mL בתוך מבחנה מסוג einor. העבר באמצעות פיפטה 240 µL של מצע גידול. הוסף 12.6 µL של heaps בריכוז 1 M, 20 µL של מים מסוננים, 50 µL של תמיסת תאים ו-10 µL של החלקיקים הפלואורסצנטיים.

לבסוף, הוסיפו 167 µL של קולגן מהדרמיס של בקר, וערבבו את התמיסה היטב. כעת, העבירו 80 µL על החלק הזכוכיתי של הצלחית הסילילית שהוכנה. הדגירו בטמפרטורה של 37 °C למשך 50 דקות כדי לאפשר לג'ל לעבור פולימריזציה.

לאחר מכן, הוסיפו בזהירות 2 mL של מצע גידול. יישוו את תא המיקרוסקופ לטמפרטורה יציבה של 37 °C והשלימו את מצע התאים. כדי לשמור על pH ניטרלי עבור דימויי DIC, החליפו את מכסה הצלחית במכסה זכוכית עם רצועה דקה של פאראפילם.

כסו את דופן הצלחת כדי למנוע התאיידות עבור עדשת שמן (oil immersion). הניחו טיפה אחת של נוזל טבילה במיקום העדשה. הניחו את הצלחת המכילה את ג'ל הקולגן עלבמת המיקרוסקופ כך שהצלחת תיבוא במגע עם נוזל הטבילה.

מקדו את הדגימה וחפשו תאים רלוונטיים לצילום כדי למזער את סחיפת השולחן. המתינו כ-45 דקות עד שהצלחת תתייצב. לפני תחילת רצף צילום ארוך, הגדירו את פרמטרי רכישת התמונה עבור ניסויי הוספת מעכבים.

הכינו מצע תזונה מועשר בתרופה בריכוז העבודה הרצוי. השלימו את מצע התאים כדי לשמור על pH ניטרלי, אך אל תאטמו עם perfil. העבירו את הדגימה למיקרוסקופ והמשיכו בדימות במועד הטיפול בתרופה.

השהה את התמונה, תפס והסר בזהירות את מכסה הצלחת מבלי להסיט את הצלחת עצמה. שאב את המצע והעבר בעזרת פיפט את המצע המכיל את התרופה אל תוך הצלחת. לאחר מכן, החזר בזהירות את המכסה למקומו.

ההגדרות למערך FRAP עשויות להשתנות בין מערכות שונות, לכן יש להיוועץ בהוראות היצרן. ראשית, הגדירו את הפרמטרים עבור דימוי תאים חיים.

עבור הבהרה פוטוכימית (photobleaching). יש לבחון פרמטרים אלו על תאי תרגול כדי להשיג עוצמת לייזר מספקת להבהרת האות הפלואורסצנטיי ללא פגיעה בתא. לאחר מכן, התחל בלכידת תמונות של הדגימה ורכוש לפחות חמישה פריימים.

לאחר מכן, בצעו פוטובליצ'ינג (photobleach) לאזור העניין. המשיכו בלכידת תמונות לאורך זמן ההתאוששות. מדדו את עוצמת הפלואורסצנציה הממוצעת של האזור שעבר פוטובליצ'ינג לפני ואחרי הפעולה לאורך זמן, באמצעות תוכנה לניתוח סטטיסטי.

התאימו את עקומת ההתאוששות למשוואה האקספוננציאלית. השגיאו את הפרמטרים עבור זמן מחצית החיים והעוצמה הסופית מעקומת ההתאמה האקספוננציאלית. לאחר מכן, חשבו את הפракציה הניידת על ידי חישוב היחס בין עוצמות הפלואורסצנציה הסופית וההתחלתית.

תמונות תלת-ממדיות אלו של תאים חיים מציגות תאי אפיתל בריאים המבטאים actin-GFP. לאחר ארבעה ימי תרבית, תאים אלו יצרו ציסטה במטריצת קולגן תלת-ממדית. חלק מהתאים נדדו לאורך פני השטח של הציסטה בעוד שאחרים נדדו בתוך פנימיה של הציסטה.

עיוות המטריקס כתוצאה מכוחות המתיחה המופעלים על ידי תאים נודדים, ננתח באמצעות תזוזת חלקיקי סמן המוטמעים במטריקס הסובב. השפעת עיכוב של RO kinase על כוח המתיחה מוצגת כאן. תנועות חלקיקי הסמן מוצגות כתמונת היטל מקסימלי (maximum projection) של נקודות זמן שונות, כאשר כל נקודת זמן צבועה בצבע פסאודו.

לחלופין, התמונות של חלקיק סימון בודד מוצגות כמסך תמונות (montage) כדי להראות את תנועת חלקיק הסימון. עם הזמן, חלקיק סימון זה נע לעבר השפה האחורית של התא הנודד ומרחקה, לפני ואחרי הוספת Y 2 7 6 3 2 בהתאמה. ניתוח ה-frap עוקב אחר תאים המבטאים GFP actin בעודם נודדים במטריצה תלת-ממדית, המעידה על התאוששות פלואורסצנציה טיפוסית. לאחר ניסוי של הלבנה פוטו-כימית (photo bleaching) בהגדרות לייזר מותאמות, עוצמת הפלואורסצנציה של אזור העניין (ROI) פחתה באופן נראה לעין בהשוואה לרמת הרקע, תוך שמירה על תאים בריאים שאינם פגומים.

גרף זה מציג את התאמה של עקומת ההתאוששות לפונקציה מעריכית. לאחר רכישת מיומנות, זריעת התאים במטריצה עשויה להימשך שעה. אין לשכוח כי עבודה עם amino propyl trimethyl עלולה להיות מסוכנת ביותר.

לכן, נקטו באמצעי זהירות כגון עבודה במכסה מ photochemical (מapay). כמו כן, זכרו לשמור על תנאי סטריליות בעת עבודה עם תאים במטריקס תלת-ממדי (3D matrix).