הפקה של microarrays רקמות, צביעה אימונוהיסטוכימיה ו דיגיטציה בתוך אטלס החלבון האנושי

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להשתמש בשיטה יעילה להשגת מידע סימולטני ממספר רקמות עבור ביטוי חלבונים בפרויקט בעל תפוקה גבוהה, כגון ה-human protein atlas. זאת מושג תחילה על ידי בחירת אזורים מייצגים של רקמות מקובעות בפורמלין ומוטמעות בפרפין. לאחר מכן, אזורים מסומנים ננקבים והליבות שנבחרו מורכבות לתוך בלוק פרפין אחד, המכונה מערך רקמות זעיר (tissue microarray).

לאחר מכן, נחתכים סנשנים מה-TMA ומתבצעת אימונוהיסטוכימיה. לבסוף, דפוס ביטוי החלבון מנותח והנתונים מפורסמים ב-human protein atlas. בסופו של דבר, ניתן להגיע לתוצאות המראות ביטוי של חלבונים ברקמות ובתאים באמצעות מערכי רקמה זעירים (tissue microarrays) ואימונוהיסטוכימיה.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון ביצוע אימונוהיסטוכימיה מבלוקים של רקמת פרנכימה בודדים, הוא שניתן לחסוך חומר ביולוגי יקר והניסויים ניתנים לשחזור בצורה טובה יותר. יתרון נוסף של טכניקה זו הוא היכולת להפחית עלויות של ENT וכן את זמן העיבוד במעבדה. את הפרוצדורה ידגים איאן קול ביי, טכנאי מעבדה מהמעבדה שלי, לצורך השגת אורך סטנדרטי של ליבות הרקמה.

סמנו את הסטיילט (stylet). מומלץ להשאיר שוליים של 2.5 עד 3.0 מילימטרים מכל צד של בלוק הפרפין כדי למנוע סדקים בפרפין בעת הצבת המנקבים (punches) המתאימים. שחררו את ברגי ראש המשושה (hex socket) המחזיקים את המנקב במקומו, ומקמו את המנקב כך שהחריץ במרכז המנקב יהיה צמוד היטב למוט המתכת בבלוק ה-V הפלסטי.

הדק את הברגים, וודא שקצה התפס המתכתי אופקי. הכנס את המחורר של המקבל (recipient punch) משמאל ואת המחורר של התורם (donor punch) מימין. השתמש בידיות כיוון ה-XY ובקריאות המיקרומטר הדיגיטלי שלהן כדי להזיז את המחוררים לאורך צירי X ו-Y.

כדי לאפס את המכונה, לחצו על כפתור ה-zero a BS למעבר בין אינצ'ים למילימטרים, לחצו על כפתור ה-inch millimeter. בעת שימוש במנקב של 1 mm עבור תבנית של 9 על 8, המרווח בין החורים צריך להיות 2 mm כפי שנמדד בין מרכזי החורים; כדי למנוע דחיפה מוגברת של המנקב המקבל למטה ונזק למנקב, הגדירו את העומק המקסימלי לדחיפת המנקב על ידי הנחת קסטה ריקה בתושבת ושימוש בבורג מעצור העומק בפינה השמאלית העליונה של מדריך ה-Z, הגדירו את מיקום התחתון של המנקב המקבל ל-1 mm מעל תחתית הקסטה. לאחר בחירה וסימון של האזור הרלוונטי בחתך רקמה ותכנון תבנית לייצור מערך מיקרו של רקמות (TMA), הניחו את בלוק המקבל בתושבת והשתמשו במברג הקטן ביותר כדי להדק את הברגים.

הימנעו מהדקה מופרזת של הברגים כדי למנוע מהפראפין להישחרר מהקסטרה. דחפו את המנקב המקבל למטה כ-5 mm לתוך בלוק המקבל, והשתמשו בידית של המנקב כדי לסובב אותו קדימה ואחורה. לאחר מכן, שחררו לאט את לחץ הדחיפה כלפי מטה, כך שהקפיצים יוכלו להעלות את המנקב.

השתמשו בסגנון כדי לרוקן את המחסן ולהשליך את ליבת הפרפין. לאחר מכן, העבירו את הצריח כדי לעבור למחסן התורם. בשלב הבא, הניחו את גשר בלוק התורם, כאשר בלוק התורם נמצא מעל למחזיק בלוק המקבל.

השתמשו בנגב צביעה של המטוקסילין ואאוזין תואם שבו סומן אזור העניין כדי לאתר את הרקמה שיש לדגום. החזיקו ידנית את בלוק התורב במקומו ביד שמאל ודחפו את המנקב ביד ימין. אין לדחוף את המנדרין. מעצור העומק אינו חוסם את תנועת המנקב במיקום המתאים עבור בלוק התורב, לכן חשוב להפסיק את הדחיפה כאשר הסימון השני נראה על המנדרין.

סובב את הידית של המחורר פעם אחת באיטיות. שחרר את הלחץ כלפי מטה תוך כדי החזקת בלוק התור על גשר בלוק התור. הסר את הגשר ואת בלוק התור.

וודאו שמיקום מחלץ התורם מיושר עם החור שנוצר קודם לכן. כווןנו את מיקום המחלץ באמצעות ברגי הכיוון. אם מחלץ התורם והחור בבלוק המקבל אינם מיושרים, דחפו בעדינות את המחלץ כלפי מטה עד שקצהו יגיע לראש החור בבלוק המקבל.

תוך שמירה על תנוחה זו, השתמשו במנדרילין (stylet) כדי לרוקן את גליל הרקמה אל תוך החור. פני השטח של הגליל צריכים להיות מיושרים עם פני השטח של הבלוק. העבירו את הצריח חזרה אל המחץ המקבל.

עברו לעמדה הבאה באמצעות כפתורי כוונון ה-XY וחזרו על התהליך על ידי דגימה מהבלוק המקבל עד להשלמת המערך. כדי להסיר את הבלוק המקבל, שחררו את הברגים במחזיק. הניחו את הבלוק עם הפנים כלפי מטה על עלית זכוכית המונחת על מעמד מתאים, ובשלו את הבלוק בטמפרטורה של 42 °C למשך 40 דקות.

הוציאו את השקופית ואת הבלוק מהתנור והחליקו את פני השטח של הבלוק על ידי הברשה עדינה של שקופית הזכוכית. הניחו את הבלוק עם שקופית הזכוכית על פלטת קירור למשך 10 דקות. הסירו את שקופית הזכוכית מהבלוק.

הבלוק מוכן כעת לחיתוך. לאחר החיתוך, יש לבצע צביעה ודיגיטציה של מערך הרקמות (tissue microarray) באמצעות נוגדן לחלבון הנבדק. ניתן לחפש את החלבון במאגר החלבונים האנושי (Human Protein Atlas) באמצעות האתר www.proteinatlas.org.

הזינו את שם החלבון המבוקש, מזהה ensemble, מספר גישה של UniProt או שם HGNC, לדוגמה, insulin. לחצו על החלבון המבוקש וגללו למטה אל סיכום הרקמות והאיברים הנורמליים. הסקירה מציגה ביטוי חלבון בלבלב.

לחצו על הלשונית. נתוני רקמות נוספים. תצוגת הרקמות הנורמליות הממוינת לפי איבר תופיע.

לחצו על הלבלב כדי לצפות בתוצאות ה-IHC עבור שלושה נוגדנים המכוונים לאותו חלבון. לחצו על תמונה כדי לצפות בתמונה ברזולוציה גבוהה של הלבלב. באיור זה מוצגות דוגמאות לאיכות של מערכי מיקרו-רקמות (tissue microarrays), מערך ישר ומיושר כראוי עם מרווח מספיק בין השורות והעמודות לבין קצה הפרפין. כאן, חלק מהליבות קרובות מדי לקצה, מה שככל הנראה יגרום לבעיות במהלך החיתוך.

מערך רקמות זה (tissue microarray) נאפה זמן רב מדי וקרס ללא התבנית הנכונה. כאן, סניט שגזרו כראוי עם עמודות ישרות ומיושרות נצבע ב-hematoxylin ו-eosin. להב פגום או מלוכלך עלול לגרום לפיצול כפי שמוצג כאן או לסניטים דחוסים כגון אלו.

תאי מרכז נבטי (germinal center) בקשרי לימפה מראים תיסבוב אופטימלי של נוגדנים, מה שמוביל לצביעה ציטופלזמית ספציפית ללא רקע, כפי שניתן לראות כאן. צביעה שלילית או חלשה מופיעה כאשר ריכוז הנוגדן הראשוני נמוך מדי, או אם חלבון המטרה אינו נוכח ברקמות שנצבעו אימונוהיסטוכימית. חתך רקמה זה סובל מצביעת יתר עקב ריכוז גבוה מדי של הנוגדן הראשוני.

הצבע הכהה גורם לקשיים בקביעת המיקום התת-תאי עקב זליגה (spillover), תגובתיות צולבת וחיוביות שגויה. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי האופן שבו מייצרים מערך סממנים רקמתיים (tissue marker array) וכיצד להשתמש בו בעת ניתוח ביטוי חלבונים בביצוע אימונוהיסטוכימיה. כמו כן, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן הדפדוף ב-human protein atlas לצורך בדיקת ביטוי חלבונים ברקמות ובתאים אנושיים.