הנדסת Hydrogel Bilayered לשלוט בידול ASC

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא ליצור מטריצה מרוכבת העשויה מחומרים ביומטיים טבעיים, שניתן להשתמש בה להחדרה והביניה של תאי גזע כדי לסייע בריפוי פצעים. מטרה זו מושגת תחילה על ידי בידוד תאי גזע ממקור שומני או a SC מבעל ניסויים. לאחר מכן, ה-A SC נטענים על גבי מיקרוספירות קיטוזן שהוכנו מראש.

לאחר מכן יוצקים ג'ל קולגן מסובב (FIBRILLATED), ומניחים את חרוזי ה-A-S-C-C-S-M בשכבה מעל ג'ל הקולגן. לבסוף, יוצקים ג'ל PEG fibrin מעל ג'ל הקולגן עם ה-A-S-C-C-S-M, ומוסיפים מצע גידול. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות נדידה סימולטנית דו-כיוונית של A SC מחרוז ה-CSM לתוך מטריצות הקולגן וה-PEG fibrin.

באמצעות הליך זה, מקור בודד של תאי גזע יכול לקבל רמזים דיפרנציאליים מסביבות המיקרו של הקולגן וה-PEG fibrin, ולהיות מעורר באופן דיפרנציאלי לייצר גורמים פלאיוטרופיים ולהקים רשת של מבני קדם-כלי דם. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון קומפוזיטים מחומר בודד או תחליפי עור דה-צלולריים, הוא שמוצרים אחרים אלו אינם מטפלים באופן פעיל ברבסקולריזציה של המוצר על ידי המארח. הרעיון לשיטה זו עלה לראשונה כאשר הבחנו כי ל-RAD A SE מבודד יש נטייה להבדיל לעבר פנוטיפ וסקולרי כאשר הוא גודל במטריקס פיברין של חזיר.

תצפית זו עוררה את הרעיון שניתן להשתמש במקור בודד של תאי גזע בו-זמנית במערכת המורכבת מחומרים ביומטיריים שונים. לאחר בידוד וטיפוח של תאי גזע מהרקמה השומנית (ASCs), הכנת מיקרוספירות קיטוזן (CSMs) והטמעת ה-ASCs בתוך ה-CSMs, הכין הידרוג'ל פוליאתילן גליקול ופיברין על ידי המסה של peg modified succinyl glutarate ב-4 mL של tris buffered saline. רגע לפני הניסוי, השתמש במסנן של 0.22 micron כדי לעקר את התמיסה.

בתוך באר תרבית של פלטה בעלת שישה בארות, ערבבו 500 µL של תמיסת מקור של fibrinogen ו-250 µL של תמיסת מקור של PEG, והדגרימו למשך 20 דקות באינקובטור לח עם 5% CO2 בטמפרטורה של 37 °C. לאחר מכן, ערבבו 250 µL של A-S-C-C-S-M שהוכן מראש עם תמיסת ה-fibrinogen הפגילציה, הוסיפו מיד 1 mL של תמיסת מקור של thrombin, ובעזרת פיפט, בצעו ערבוב מהיר (trirate) פעם או פעמיים. העבירו מיד את תערובת התאים והג'ל לפלטה בעלת 12 בארות והדגרימו בתא לח עם 5% CO2 בטמפרטורה של 37 °C למשך 10 דקות. לאחר מכן, שטפו את ה-peg fibrin שהתקבל פעמיים עם HBSS והדגרימו עם alpha minimal essential medium מועשר ב-10% FBS באינקובטור לח עם 5% CO2 בטמפרטורה של 37 °C, תוך מעקב בטכניקות מיקרוסקופיה של אור סטנדרטי לאורך תקופה של 11 ימים.

עקבו אחר נדירת התאים מה-CSM אל תוך תערובת הג'ל, A-S-C-C-S-M עם קולגן מסוג 1 שהופק מגידי זנב של חולדה באמצעות נתרן הידרוקסיד נורמלי כפול. כווננו את ה-pH ל-6.8 ובצעו פיברילציה. הוסיפו את הקולגן שעבר פיברילציה, תערובת A-S-C-C-S-M, לפלטה בעלת 12 בארות והדגרימו באינקובטור לח עם 5% carbon dioxide בטמפרטורה של 37 °C למשך 30 דקות.

לאחר בדיקה שהפיברילציה הושלמה, דגרו את ג'לי ה-collagen A-S-C-C-S-M למשך עד 11 ימים באינקובטור לח עם 5% carbon dioxide בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. עקבו אחר נדירת התאים מה-CSM אל תוך הג'ל לאורך תקופה של 11 ימים באמצעות טכניקות מיקרוסקופיה סטנדרטיות, כדי לפתח את המבנה הדו-שכבתי לבחינת תכונות הנדירה והאינדוקציה המשותפת של מקור יחיד של תאי גזע, תוך שימוש בשני פיגומים ביולוגיים.

הכינו הן את ג'לי הקולגן והן את ג'לי ה-PEG fibrin עם השינויים הקלים הבאים: הכינו מיליליטר אחד של קולגן בריכוז 7.5 milligrams per milliliter. לאחר מכן, העבירו את התערובת למסרק תרביות רקמה בעל שישה בארות והדריגו למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. לאחר פיברילציה מלאה, שפכו על פני השטח של הקולגן 200 microliters של 5 milligrams של A-S-C-C-S-M במצע תרבית.

לאחר שהמיקרוספירות שקעו על הג'ל, הכין את ג'ל ה-PEG fibrin באמצעות 250 µL של מצע גידול תאים. לאחר מכן, הנח שכבה של תמיסת פברינוגן תרומבין פגילציה מעל שכבות הקולגן של ה-A-S-C-C-S-M. עם השלמת התהליך, דגרי את המבנים למשך 30 דקות באינקובטור לח עם 5% carbon dioxide להשגת פולימריזציה מלאה.

לבסוף, מקריאו מיליליטר אחד של מצע לתא השכבתי העליון מעל למבנה ושלושה מיליליטרים של מצע לתא השכבתי התחתון. אפיון של תא גזע (SC) השבוי בתוך פיגום זה גילה כי ניתן להניח תאי גזע טעונים ב-CSMs בין שכבת קולגן לבין peg fibrin בו-זמנית, וכי הם יכולים לקבל רמזים בצורה דיפרנציאלית משתי הסביבות החוץ-תאיות על מנת לשגשג בתנאיהם החדשים. כפי שמוצג כאן, הקולגן תמך ביכולתם של ASCs להישאר תאי גזע, כפי שהוכח על ידי ביטוי של stro one בירוק, כמו גם על ידי המורפולוגיה הדמוית פיברובלסט שלהם.

בניגוד לכך, PEG fibrin הוביל את ה-ASCs להבדיל לכיוון פנוטיפ א-וסקולרי (ללא כלי דם), כפי שמוצג כאן על ידי המורפולוגיה דמוית-הצינור שלהם, הכוללת לומן וביטוי של הגורם von Willebrand הספציפי לתאי אנדותל המוצג כאן באדום. בנוסף, כפי שמוצג כאן, נראה כי פנוטיפים אלו הופיעו בשלב מוקדם של התרבית ונשמרו לאורך 11 ימים. לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי הדרך לבידוד תאי גזע המופקים מרקמת שומן של חולדה, טעינתם על גבי מיקרוספירות של chitosan, ושילובם בתוך הידרוג'ל דו-שכבתי תוך שימוש בביומטריאלים המאושרים על ידי ה-FDA.

יש לזכור כי הביומטריאליים והתאים המשמשים בפרוטוקול זה מופקים מבעלי חיים ומבני אדם, והם עלולים להיות מסוכנים ביותר אם הם מזוהמים בפתוגנים מהמארח שלהם. יש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון ציוד מגן אישי וטכניקות אספטייות לתרבית תאים, בעת ביצוע הליכים אלו.