לדוגמא הכנה של
3 בספטמבר 2012
הפרופיל של metabolomic Mycobacterium tuberculosis נקבע לאחר צמיחה בתרבויות ציר מרק. תנאים יכולים להיות מגוונים כדי לבדוק את ההשפעות של תוספי תזונה, חמצון, וסוכנים נגד שחפת על הפרופיל המטבולי של מיקרואורגניזם זה. נוהל להכנת תמצית היא ישים עבור שניהם 1D 1 H ו2D 1 H- 13 C ניתוחי NMR.
מטרתו של הליך זה היא לנתח תמציות נטולות תאים של mycobacterium tuberculosis באמצעות מטבוליזים ב-NMR; ראשית יש לתרבת ולקצור את התאים בשלב גדילה מתאים. לאחר מכן, יש לבצע ליזיס לתאים ולהפיק תמציות נטולות תאים לצורך ניתוח. יש להמיס מחדש את התמציות הליופיליזיות בבופר לצורך ניתוח NMR.
לבסוף, אספו נתוני NMR ונתחו את הספקטרום באמצעות תוכנה כדי לזהות מטבוליטים. בסופו של דבר, ניתוח NMR של mycobacterium tuberculosis משמש להדגמת שימור ברמות המטבוליטים תחת טיפולים שונים. ניתן להחיל מטבולומיקה מבוססת NMR על היבטים מרכזיים בפיזיולוגיה של mycobacterium tuberculosis, כגון מסלולים מטבוליים חשובים.
הבנה זו היא קריטית כדי להבהיר את מנגנוני הפעולה של התרופות ואת מנגנוני העמידות, וכדי לזהות מטרות חדשות לתכנון תרופות. באופן כללי, אנשים שאינם בקיאים בשיטה זו עלולים להתקשות עקב חוסר יכולת לטפל בכל הדגימות באופן זהה לחלוטין, דבר שיביא לשונות מיותרת בתוצאות מהמעבדה שלי. סטיבן לוקה, דוקטורנט, ידגים את נהלי הטיפול בדגימות לעיבוד NMR מהמעבדה שלי; כעת ידגימו מנהל מעבדת המחקר ורוברט פנטון, טכנאי מחקר 3, את נהלי הטיפול בתרביות mycobacterium tuberculosis בעת ביצוע עבודות עם M tuberculosis.
המחקר בוצע בהתאם לנהלי בטיחות ביולוגית רמה 3 (BSL-3) כפי שהוגדרו בהנחיות המוסדיות. למרות שהתוויות בסרטון זה מציינות microbacterium tuberculosis מסיבות של בטיחות ביולוגית, בהדגמה זו נעשה שימוש ב-mycobacterium magmatic שאינו פתוגני. התחילו בהפשרה על קרח של מלאי 50% glycerol של M tuberculosis.
החדרו 0.15 milliliters לתוך 110 milliliters של מצע צמיחה M-A-D-C-T-W בתוך בקבוק ER בנפח 250 milliliter, וגדלו את התרביות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius עם ניעור ב-100 RPM למשך כשישה ימים. אם נדרשים אנטיביוטיקה, תוספים חלופיים או טיפולים אחרים, בצעו אותם. קצרו את התרביות עבור תרביות הדורשות טיפולים.
הפרישו 0.5 milliliter של Eloqua על קרח לצורך תרבית, תיתוּר ובקרת איכות. לאחר מכן, בצעו את הטיפול הרצוי והחזירו את התרביות למנער לאחר תקופת זמן הטיפול. הוציאו one milliliter וקבעו את ה-OD 600.
בנוסף, השאירו דגימה של 0.5 milliliter לתרבית, תיתור ובקרת איכות. שמרו את התאים על קרח לאורך כל המשך הפרוטוקול. אספו את התאים לארבעה מבחנות של 50 milliliter באמצעות סנטריפוגציה לאחר שטיפה עם 15 milliliter של מים מזוקקים פעמיים קרים מאוד.
ריס מרחף את המשקעים באליקוטות של 10 milliliter. יש להוציא שתי אליקוטות ולהשקיע אותן באמצעות סרכוז, ולאחר מכן להרחף מחדש את משקע התאים בנפח סופי של one milliliter של מים מזוקקים פעמיים. אם נדרש תגלה של תאים בודדים ללא התגבשות, העבירו את התאים דרך מחט בכילייבר 27 gauge.
העבר שלוש פעמים תמיחת תאים של 1 mL למבחנה עם פקק הברגה בנפח 2 mL המכילה lysing matrix B. מקם את הומוגניזר הליזה fast prep 24 בתוך קבינת הבטיחות הביולוגית. הנח את הדגימות במחזיק הדגימות והדק את לוחית השמירה. לאחר מכן, בצע עיבוד למשך 60 שניות בהגדרת מהירות של 6 m/s.
בשלב הבא, סבב את הדגימות בצנטריפוגה כדי לשקיע את פסולת התאים ותאים שלמים. לאחר מכן, העבר את העלייה דרך מסנן מזרק של 0.2 micron לשפופרת סטרילית כדי לוודא את היעדרם של תאים חיוניים. זרע 0.1 milliliter מהדגימה על MADC.Agar.
הקפיאו את הדגימות באמבט של אתנול וקרח יבש ואחסנו אותן בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס עד שיהיו מוכנות לליופיליזציה ולעיבוד במתקן NMR. לאחר חודשיים, בדקו את הצלחות כדי לוודא היעדר יחידות יוצרות מושבות (CFU). אם לא נמצאו CFU, ניתן להוציא את הדגימות ממעבדת BSL 3 לצורך ניתוח נוסף במתקן NMR סטנדרטי.
לאחר ייבוש הדגימות עד ליובש מלא, השביה אותן מחדש ב-0.7 milliliters של בופר NMR והעבר למבחנה של מיקרו-צנטריפוגה; סבב בצנטריפוגה למשך שלוש דקות ב-13,000 ×g. הסר 0.6 milliliters והעבר למבחנת NMR של חמישה מילימטרים. לצורך ניתוח המדיה, מתקן מותאם אישית מקל על טעינת מספר מבחנות NMR לתוך הספינרים בעומק הנכון.
לאחר מכן, העבירו את הדגימות לספקטרומטר ה-NMR להכנסה למחלף דגימות A-B-A-C-S one 20. יש להחליף בין תרביות לא מטופלות לתרביות מטופלות בתרופה. יש להטעין מראש את הדגימה הראשונה למגנט בתחילת הרצה אוטומטית.
כדי לכיול המכשיר, בצעו אופטימיזציה לאורך הפולס של 90 מעלות עם דגימה אחת וכיילו את המכשיר עבור שאר הדגימות. השתמשו בסמלי ה-NMR ו-grad shim. הפעילו אוטומציה לנעילה (locking), לשימינג (shimming) ולאיסוף נתוני NMR עבור כל דגימה.
עבור ספקטרום NMR חד-ממדי של מימן (1H), בחרו את רצף הפולסים עם דיכוי מים ופיסול עירור (excitation sculpting). הגדירו סך של 32,000 נקודות נתונים, 128 סריקות ו-16 סריקות דמי (dummy scans) עבור ספקטרום דו-ממדי של 1H-13C HSQC. בחרו את רצף הפולסים.
בחר סך של 2048 נקודות נתונים עם רוחב סריקה (sweep width) לאורך ממד ה-H one הישיר ו-64 נקודות נתונים עם רוחב סריקה לאורך ממד ה-C 13 העקיף. כמו כן, הגדר איסוף ספקטרום עם 128 סריקות ו-16 סריקות דמי (dummy scans) כדי להשיג יחס אות לרעש טוב. ספקטרום של m tuberculosis ייצר כ-400 שיאים, כולל 50 מטבוליטים ידועים.
לדוגמה, עיבוד נתונים כפי שפורט בכתב היד המצורף הפיק ספקטרום זה של מטבוליטים הקשורים באופן ישיר או עקיף למסלול ה-D alanine. עוצמת הפסגות פרופורציונלית לריכוזי המטבוליטים הנמצאים בתמצית התאים, כך שניתן לכמת שינויים יחסיים במטבוליטים ובמסלולים מטבוליים בין דגימות וטיפולים שונים. מטבוליקה בשיטת LMR סוללת את הדרך לחוקרים בתחום הבקטריולוגיה לחקור פיזיולוגיה ופתוגנזה באופן ויזואלי במיקרו-בקטריות, ובמיקרואורגניזמים פתוגניים או לא-פתוגניים אחרים.
לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה לגבי אופן הכנתם של תמריות תאים מרובות של שחפת עבור מטבוליאומיקה ב-NMR, ובאופן חשוב, כיצד לשמור על עקביות לאורך הפרוטוקול כולו כדי להשיג תוצאות מהימנות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מתמקד בניתוח הפרופיל המטבולומי של Mycobacterium tuberculosis באמצעות מטבולומיקה מבוססת NMR. הפרוצדורה כוללת גידול של החיידקים בתרביות ציר ומסירת תמריות נטולות תאים לצורך ניתוח.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מטבולימיקה
- מיקרוביולוגיה
- Mycobacterium tuberculosis
רקע
- Mycobacterium tuberculosis הוא פתוגן משמעותי האחראי למחלת השחפת.
- הבנת הפרופיל המטבולי שלו יכולה לספק תובנות לגבי הפיזיולוגיה שלו.
- מטבולומיקה מבוססת NMR היא כלי רב עוצמה לניתוח מטבוליטים.
- שינויים בתנאי הצמיחה עשויים להשפיע על הפרופילים המטבוליים.
מטרת המחקר
- ניתוח הפרופיל המטבולי של Mycobacterium tuberculosis.
- הערכת ההשפעות של תוספי תזונה וטיפולים על המטבוליזם.
- שימוש בניתוח NMR לזיהוי מטבוליטים בתמציות נטולות תאים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- גידול של Mycobacterium tuberculosis במצע נוזלי.
- איסוף התאים בשלב גדילה מתאים.
- ליזיס של התאים להשגת תמציות נטולות תאים.
- ריסספנזיה של התמציות בבופר עבור אנליזת NMR.
תוצאות עיקריות
- ניתוח NMR חושף שינויים ברמות המטבוליטים בעקבות טיפולים שונים.
- זוהו מסלולים מטבוליים מרכזיים שהושפעו מתנאים שונים.
- הוכשירה הישימות של מטבולומיקה מבוססת NMR במחקר של Mycobacterium tuberculosis.
- סופקו תובנות לגבי ההיבטים הפיזיולוגיים של החיידק.
מסקנות
- מטבוליזמיקת NMR יעילה לניתוח של Mycobacterium tuberculosis.
- שינויים בתנאי הצמיחה משפיעים באופן משמעותי על הפרופילים המטבוליים.
- גישה זו יכולה להגביר את ההבנה של המטבוליזם של השחפת.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית לדרג הניהולי
פרופיל מטבולימי חסון של תמציות Mycobacterium tuberculosis באמצעות NMR מאפשר בחינה ברמת ביטחון גבוהה של מסלולים מטבוליים תחת טיפול תרופתי והפרעה גנטית. זרימה זו של עבודה תומכת בתיקוף מטרות ובצמצום סיכונים מכניסטיים בשלב הגילוי, ומספקת מידע ישיר לזיהוי ותיעדוף של מולקולות מובילות לפיתוח תרופות נגד שחפת. נתונים כמותיים ואמינים של מטבוליטים משפרים את הביטחון החזוי ואת ההמשכיות התרגומית לאורך צינור הגילוי המוקדם.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר השוואה כמותית של פרופילים מטבוליים בין זנים מסוג בר (wild-type) לזנים מוטנטיים תחת טיפולים שונים.
- תומך בזיהוי שיבושים במסלולים מטבוליים הקשורים להשפעת תרופות או למנגנוני עמידות.
- מסייע בתיקוף תפקודי של מטרות באמצעות קישור בין שינויים בגנים או בחלבונים לבין שינויים במטבוליטים.
- מספק הפחתת סיכונים מכניסטית על ידי הבהרת השפעות ביולוגיות במורד הזרם של התערבויות מועמדות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק הכנה סטנדרטית וניתנת לשחזור של דגימות לצורך כימות מטבוליטים מבוסס NMR.
- מפיק תוצרי כימות באיכות גבוהה המתאימים לסריקת השפעות של תרכובות על מטבוליזם חיידקי.
- מאפשר התרחבות של הבדיקה (scalability) ושימוש חוזר בפלטפורמה עבור תנאים ניסויים מגוונים וספריות תרכובות.
- תומך בהערכה מהימנה של תגובות מטבוליות למועמדים לתרופות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאם מדדים מטבוליים עם נתיבים רלוונטיים למחלה לצורך חקירה של סממנים ביולוגיים תרגומיים.
- מספק רציפות מתובנות מטבוליות בשלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של השפעות תרופתיות.
- מאפשר קבלת החלטות על קידום מותאם סיכון בהתבסס על הפרעות מטבוליות כמותיות.
- תומך בהפחתת סיכונים חזויה לבחירת מועמדים בקווי פיתוח של תרופות לשחפת.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
תהליך עבודה זה למטבולומיקה באמצעות NMR משלב שלבים החל מגילוי ראשוני, דרך זיהוי מובילים (leads) ועד למחקר פרה-קליני, ובכך תומך בתיקוף מטרות מונחה-השערות ובמחקרים מכניסטיים.
- ביולוגיה של הגילוי: פרופיל מטבוליטים כמותי מבהיר את מעורבות המסלולים ואת התגובה הביולוגית להתערבויות.
- סריקה: הכנה סטנדרטית של דגימות ואנליזת NMR מאפשרות תוצרי בדיקה כמותיים הניתנים לשחזור.
- אנליטיקה: ספקטרה ברזולוציה גבוהה וניתוח סטטיסטי מקלים על השוואה חסונה של מצבים מטבוליים בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: נתוני מטבוליטים מסייעים להתאמת סממנים ביולוגיים ולבחינת הרלוונטיות למחלות במודלים פרה-קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: הפרוטוקול ניתן להתאמה עבור אנליזה פרוטאומיקה מקבילה וניתן להרחבה למספר תכנונים ניסיוניים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: מספק זרימות עבודה של מטבולומיקה סטנדרטיות, הניתנות לשחזור ובקנה מידה רחב.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת של go/no-go ומפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים בפורטפוליו של תרופות נגד שחפת.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ובקידום של מועמדים לתרופות המכוונים ל-M. tuberculosis.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול ברמת בטיחות ביולוגית 3 (BSL-3) ובמטבולומיקה באמצעות NMR.
- דורש גישה למכשור NMR בשדה גבוה ולתוכנה אנליטית.
- מחייב סטנדרטיזציה קפדאי בין צוותים כדי למזער שונות בין הדגימות.
- ניתן להתאמה לשימוש עם מערכות מיקובקטריאליות או מיקרוביאליות אחרות באמצעות שינויים בפרוטוקול.
- עקביות הדגימות ועמידה בדרישות הבטיחות הביולוגית הן קריטיות לקבלת נתונים מהימנים ובעלי משמעות מעשית.
