רדיואקטיבי באתרו הכלאה לזיהוי תבניות ביטוי מגוונות גנים רקמות

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לזהות אזורים של ביטוי גן ספציפי ולאפיין את התזמון ואת רמות ביטוי הגן כדי לתרום להבנת תפקוד הגן. מטרה זו מושגת על ידי קציר והכנה מהירים של הרקמה שתשמש בפרוצדורה, במטרה לשמר את שלמות הרקמה. כשלב שני, הרקמה עוברת טיפול להפחתת קישור הרקע של גששי ריבו (ribo probes).

בשלב הבא, מתבצעת היברידיזציה של הגששים (ribo probes) לרקמה, ולאחר מכן ויזואליזציה של קישור גשש ה-RIBA. בעזרת סרט רנטגן או אמולסיה רגישה לאור, מתקבלים תוצאות המראות את המיקום ואת רמת ביטוי הגנים, בהתבסס על תמונות רנטגן או ניתוח במיקרוסקופיה בשיטות שדה בהיר (brightfield) ושדה כהה (darkfield). בעת שימוש בתוכנת Image J, ישנם מספר שלבים קריטיים שחובה לבצע היטב ובהם רבים טועים, ואחד מהם הוא מניעת רקע.

ישנם מספר שלבים שעלולים לגרום לרעש רקע, כגון סטורציה לקויה או היברידיזציה בטמפרטורה לא נכונה. גורם נוסף הוא זיהום ב-RNA שיגרום לפירוק של הגשוש (probe) ה-RNA שלך. לכן, יש להקפיד שכל הציוד והחומרים יהיו נקיים מ-RNA.

והשלישי הוא שכאשר טובלים את השקופיות באמולסיה, עליכם לוודא שאין דליפות אור בחדר החשכים או חשיפה של האמולסיה לאור לאורך כל שלבי התהליך, שעלול להימשך שלושה שבועות. את הטכניקה הזו תדגים Hun Chen, פוסט-דוקטורנט במעבדה שלי. לאחר הוצאת מוח טרי ושטיפה ב-1x PBS, טמיעו את המוח במדיום OCT tissue tech על ידי טבילת המוח בתבנית המכילה את המדיום בטמפרטורת החדר.

ודאו שהמוח מונח בכיוון הדרוש לחיתוך. לאחר מכן, רססו את הקרח היבש באתנול והקפיאו את הרקמה על ידי הנחת הבלוק לתוך תערובת האתנול והקרח היבש. תוך הקפדה שלא יחדור אתנול אל תוך הבלוק, חתכו את הרקמה הקפואה בעזרת קריוסטט לחתכים בעובי של 10 עד 12 מיקרון, והעבירו אותם לשקופיות super plus המיועדות לרקמת מוח ורקמה עוברית.

טמפרטורת החיתוך האופטימלית היא בטווח של 18- מעלות צלזיוס עד 20- מעלות צלזיוס. יש לאחסן את החתכים בקופסת שקופיות בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס. העבירו את השקופיות מאחסון בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס למסגרת מתכת על קרח יבש.

לאחר מכן, בעבודה בתוך מנדף מאושר, מקמו את העמד בתוך תמיסה של 4% para formaldehyde שחוממה מראש לטמפרטורה הגבוהה ב-3 עד 5 מעלות צלזיוס מטמפרטורת החדר. דגרו למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר; לאחר הדגירה, הוציאו את העמד מה-para formaldehyde ושטפו את השקופיות על ידי טבילה של העמד ב-PBS כ-15 פעמים. חזרו על שלב שטיפה זה פעמיים, תוך שימוש בתמיסת PBS רעננה בכל פעם.

בשלב הבא, טבול את השקופיות בבופר אצטילציה (acetylation buffer) שהוכן זה עתה למשך 10 דקות, כדי להפחית קישור לא ספציפי של פרובת ה-RIBA. לאחר מכן, שטוף את השקופיות כפי שנעשה קודם לכן, אך הפעם השתמש ב-two times SSPE כתמיסת השטיפה. ייבש את הרקמה באמצעות סדרה של אתנול בריכוזים של 70, 95 ו-100% למשך שתי דקות בכל תמיסה.

לאחר מכן, ייבשו את השקופיות במכסוף במשך 10 עד 15 דקות לפחות. לאחר סינתזת גשש ה-RIBA, בהתאם להוראות בפרוטוקול הכתוב, חשבו את הנפח הנדרש של גשש ה-RIBA ושל תמיסת ההיברידיזציה עבור כל השקופיות. חממו מראש את תערובת ההיברידיזציה של גשש ה-Ribo ל-65 °C למשך חמש דקות.

כדי לדנטר את ה-Ribo probe, העבירו בפיפטה 100 µL מתמיס ההיברידיזציה של ה-Ribo probe ופזרו אותו על פני זכוכית הכיסוי. לאחר מכן, השתמשו בזכוכית כיסוי שנייה כדי לפרוס את התמיסה באופן אחיד על הרקמה ועל זכוכית הכיסוי. הניחו את השקופית בצורה אופקית ובמצב זקוף בתוך מתקן מתכת, ולאחר שכל השקופיות מוכנות, טבלו את המתקן באיטיות באמבט שמן בטמפרטורה של 65 °C למשך מינימום של ארבע שעות ומקסימום של 16 שעות.

השמן יוצר אטם אטום לאוויר מסביב לכיסויי הזכוכית לאחר האינקובציה. הסר כל עודף שמן ממתקן המתכת המכיל את השקופיות, ולאחר מכן הנח את המתקן בתוך מגש זכוכית או מתכת המכיל כלורופורם תחת מסיסת אדים. חזור על השטיפה עם מגש שני המכיל כלורופורם טרי.

בשלב הבא, טבל את מתקן השמורות בתוך תמיסת 0.1% betta me cap אתנול בתוספת תמיסת SSPE בריכוז פי 2, כדי לשחרר את לוחות הכיסוי ולהמיס את עודפי תמיסת ההיברידיזציה. לאחר מכן, העבר את השקופיות לתמיסה שנייה ורעננה של 0.1% betta me cap TER אתנול בתוספת תמיסת SSPE בריכוז פי 2. העבר את השקופיות ללא לוחות הכיסוי למתקן שמורות רענן במגש המכיל 0.1% beta macca TER אתנול ב-SSPE בריכוז פי 2, והדגש את הדגימות בתמיסה זו למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר כדי להסיר עודפי גשושית RNA שאינם קשורים.

לאחר מכן, העבירו את מתקן השקיקיות לפתרון SSPE בריכוז פי 2 פלוס 50% main wide שחומם מראש ל-65 degrees Celsius ומכיל beta ME capto ethanol בריכוז סופי של 0.1%, והדגרימו ב-65 degrees Celsius למשך שעה אחת. לאחר ההדגרה, השליכו פתרון זה ואת כל פתרונות השטיפה המימיים הקודמים, כמו גם את כיסויי הזכוכית (cover slips), כפסולת רדיואקטיבית. לאחר מכן, שטפו את השקיקיות פעמיים ב-0.1 times SSPE שחומם מראש ל-65 degrees Celsius למשך 30 דקות בכל פעם.

לאחר מכן, בצעו דהידרטציה לרקמה באמצעות סדרת אתנול בריכוזים של 70%, 95% ו-100% למשך שתי דקות בכל תמיסה. לבסוף, ייבשו את השקופיות במנדף במשך 30 דקות לפחות. ראשית, על מנת לקבוע האם קיים אות רדיואקטיבי ברקמה.

הניחו את השקופיות המיובשות בתוך קסטה לסרט, בעבודה בחדר חשוך תחת תאורה בטוחה, והניחו סרט רנטגן מעל השקופיות. ודאו כי השקופיות פונות לצד האמולסיה של הסרט ולאחר מכן סגרו את הקסטה. חשפו את השקופיות לסרט למשך יום אחד עד שבעה ימים, בהתאם לשפע הצפוי של התמלילים.

לאחר השלמת החשיפה, יש לפתח את סרט הרנטגן במקבע ומפתח סטנדרטיים. אות ההיברידיזציה יופיע כאזורים שחורים על הסרט, הנובעים מגבשי כסף שנחשפו באמוּלסיה, כדי לקבוע את הרזולוציה התאית ולראות את האות על הרקמה עצמה. את השקופיות טובלים באמוּלסיה פוטוגרפית ולאחר מכן צובעים בצבע ניגוד.

אם יש לצבוע את השקופיות בצביעה נגדית ב-crystal violet, יש להוציא את החתכים מהפראפין (deliquidize) בהתאם להוראות בפרוטוקול הכתוב. בשלב זה, בעבודה בחדר חשוך, שפכו מים מזוקקים לתוך מבחנה. הוציאו כמות של an NTB emulsion ודללו את האמולסיה במים מזוקקים ביחס של אחד לאחד.

לאחר המסת האמולסיה באמבט מים בטמפרטורה של 42 °C למשך 20 עד 30 דקות, העבירו אותה למכל טבילה מזכוכית בתוך אמבט מים בטמפרטורה של 42 °C למשך 20 עד 30 דקות. מפלס האמולסיה המדוללת צריך כעת לכסות את כל החתכים על השקופית כאשר השקופית טובלת בה. במידה ויש מספר רב של שקופית, ייתכן שיהיה צורך באמולסיה נוספת.

כעת טבלו את השקופיות באמולסיה המדוללת בתוך אמבט מים בטמפרטורה של 42 °C, ולאחר מכן ייבשו את השקופיות במיכל סגור ואטום לאור למשך לילה בחדר חשוך, או בתנור בטמפרטורה של 37 °C למשך שעתיים עד שלוש כאשר האורות כבויים. לאחר הייבוש, העבירו את השקופיות לקופסת שקופיות. אטמו את הקצוות בסרט בידוד שחור וכסו בנייר אלומיניום.

אחסנו את הקופסאות בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס למשך מספר ימים עד שבועות; כאשר השקופיות מוכנות לפיתוח, חממו אותן לטמפרטורת החדר. לאחר מכן, בעבודה בחדר חשוך, הוציאו את התושבת המכילה את השקופיות מהקופסאות ופתחו אותן במפתח פיתוח codec D 19 בטמפרטורה של 16 מעלות צלזיוס למשך שלוש עד חמש דקות. לאחר מכן, שטפו את השקופיות המפותחות במי ברז בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת.

לאחר מכן, הדגרו את השקופיות פעמיים בתמיסת קיבוע בטמפרטורה של 19 degrees Celsius למשך שש דקות בכל פעם; ניתן להדליק את אורות החדר במהלך הדגרת הקיבוע השנייה. כעת, שטפו את השקופיות במי ברז בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפחות. לאחר מכן, בעזרת להב תער, גרדו את האמולסיה מגב השקופית בעוד היא רטובה.

לבסוף, בצעו צביעה נגדית עם 0.3% crestal violet, ולאחר מכן בצעו דהידרציה והרכבה של השקופיות בהתאם להוראות בפרוטוקול הכתוב במידת הצורך. נקו שאריות אמולסיה מהצד האחורי של השקופיות על ידי הרטבה במים וגירוד בעזרת להב תער. שטפו את השקופיות בתמיסת 80% ethanol ונגבו בעדינות פעם אחת או פעמיים כדי להסיר לכלוך ואבק.

צלם תמונות תחת תאורת שדה אפל (darkfield) או שדה בהיר (brightfield). ייתכן שיהיה צורך לחזור על שלבי הגרידה והניקיון פעמיים עד שלוש פעמים כדי להשיג תמונות איכותיות ללא חלקיקי אבק, הנראים בקלות בשדה אפל תחת מיקרוסקופ דיסקטורי. התמונות הבאות הן דוגמאות של רדיוגרפיה עצמית של היברידיזציה in situ מסרטי רנטגן.

תמונת סרט רנטגן זו מציגה חיתוך סגיטלי של ראש שלם של ציפור שיר מסוג Zebra Finch ביום עוברי 10, אשר עבר היברידיזציה עם probe של antisense ribo ל-Fox P1. הגרגירים השחורים החשופים על הסרט מראים ביטוי של messenger RNA, כפי שניתן לראות בתוך ארבעת חלקי המוח; כאן, Fox P1 messenger RNA מועשר ב-meso alium stri aum וב-dorsal thalamus. תמונת סרט הרנטגן מציגה חיתוך מאותה ציפור Zebra Finch שעברה היברידיזציה עם 90 cents RIBA probe ל-Cuper.

TF two Co.TF two מועשר בגרעין ה-palam alium ובחלקים ונטרליים יותר של התלמוס. התמונות הבאות הן דוגמאות לאוטורדיוגרפיה של היברידיזציה במקום (in situ hybridization) משטריפי טבילה באמולסיה. תמונת השדה האפל זו, שצולמה תחת מיקרוסקופ דיסקציה, מראה חיתוך סגיטלי של ראש שלם של צופית זברה ביום השישי לאחר הבקיעה, אשר עבר היברידיזציה עם גשש RIBA אנטי-סנס ל-Fox P one.

גרגרי הכסף הלבנים החשופים באמולסיה מעל הרקמה מראים ביטוי של RNA שליח. הצבע האדום מייצג צביעת kressel violet. סרגל המقياس מייצג מילימטר אחד.

כאן התמונה מציגה חתך מאותו ציפור זברה פינץ' שהוibridized עם גשוש antisense ribo נגד coop TF two. התמונות הבאות משוות בין סימון antisense לסימון sense, המראים דפוסים שונים כפי שמוצג באוטורדיוגרפיה על סרטי רנטגן של חתכי ראש של זברה פינץ' ביום עוברי 12. הקו המקווקו מציין את מתאר המוח כולו והאות C מסמנת את המוזוליאן (cerebellum).

ניתן לראות כי הגדיל האנטי-סנס (antisense) של PAC six בא לידי ביטוי במוח, ובמיוחד באזור הוונטריקולרי. חיתוך סמוך שעבר היברידיזציה עם גדיל הסנס (sense) של PAC six אינוre מראה ביטוי רקע ברחבי ראש העובר, אך מראה ביטוי ברור בשכבת הפיגמנט של הרשתית, בדומה לגדיל האנטי-סנס. התמונות הבאות מציגות ב-C שני אותות של ביטוי גנים ושלחאות טבולות באמולסיה שנלקחו ממוח של פנזיברא (zebra finch) במהלך שלבים עובריים מאוחרים, בתצוגות שדה בהיר ושדה חשוך.

תמונה זו בשדה בהיר (brightfield) מראה ביטוי של D one B ביום עוברי 10. בחשיפה רגילה לאמולסיה, את הסימון המופיע בצבע שחור ניתן בקושי להבחין בו בהגדלה זו. תמונה זו מציגה חתך והגדלה זהים לאלו שנראו בתמונה הקודמת, אך במעבר לתצוגת שדה אפל (dark field), המראה את הסימון בצבע לבן בסטריאטום (striatum) ובתלמוס (thalamus).

תמונה זו בשדה בהיר מראה ביטוי של slit three ביום עוברי 12. לאחר חשיפת יתר של האמולסיה, ניתן לראות בבירור את הסימון השחור. SC מסמן את מיקום חוט השדרה ו-CB מסמן את מיקום המוח הקטן.

הכיוון הרוסטרלי (Rostral) הוא שמאלה. התמונה המוצגת כאן היא אותו חתך בדיוק ובאותה הגדשה, אך במבט בשדה חשוך (dark field) המראה סימון בלבן בחוט השדרה, התואם לתמונת השדה המואר (bright field). התמונות הבאות מראות רזולוציה של גרגירי כסף ברמה התאית.

מוצג כאן סימון של mRNA של Fox P1 במוח הקדמי של חולת הזברה; גרגירים של כסף מופיעים כנקודות שחורות מעל תאים שצבעו ב-cresyl violet. תמונה זו מראה ביטוי בשפע גבוה על פני תאים בודדים ב-mesoalium של חולת זברה בוגרת. תמונה זו מראה ביטוי בשפע נמוך על פני תאים בודדים ב-alium הסמוך באותו חתך.

ביטוי של mRNA של Hi Fox P1 messenger נראה בתאי המזואליום ביום עוברי 12.

התאים העובריים הנראים כאן קטנים ודחוסים יותר בהשוואה לתאי המבוגר הנראים בשתי התמונות הקודמות. לבסוף, תמונה זו מראה ביטוי ברמה נמוכה על תאים ב-alium הסמוך מאותו חתך. לאחר ביצוע הליך זה, ניתן לבצע שיטות נוספות כמו אימונוכימיה כדי לענות על שאלות נוספות, כגון באיזה סוג תא מבוטא הגן המטרה.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של אופן ביצוע ההיברידיזציה במכון. זכרו כי עבודה עם ריאגנטים רדיואקטיביים עלולה להיות מסוכנת ביותר, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון מיגון אישי, במהלך הליך זה.