תפוקה גבוהה באתרו הכלאה שיטה לאפיון דפוסי ביטוי mRNA של העכבר עוברית בדרכי השתן ואברי המין התחתון

המטרה הכוללת של נוהל זה היא להדגים דפוסי ביטוי של mRNA ברקמות של המסלול השתן-מין התחתון בעוברים של עכברים. דבר זה מושג תחילה על ידי סינתזה של גשש ריבונוקלאז (ribo probe) המסומן ב-digoxigenin מתבנית שהופקה ב-PCR. השלב השני של הנוהל הוא הפקת חתכים עבים באמצעות מיקרוטום רטט.

השלב השלישי הוא ביצוע היברידיזציה in situ בחתכים של דרכי השתן והמין התחתונות המכילים סלים מותאמים אישית. ה-mRNAs מודגשים באמצעות זיהוי אימונוהיסטוכימי של פרובים ריבונוקלאזים (ribo probes) קשורים, תוך שימוש בתשתית BM purple המשקיעה פוספטאזה אלקלית. בסופו של דבר, מיקרוסקופיה יכולה להראות את הלוקליזציה המרחבית והזמנית של תמלילי mRNA בשפע נמוך וגבוה בדרכי השתן והמין התחתונות של עכבר עוברי.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון אימונוהיסטוכימיה, הוא שג probes של ribo הם קלים להפקה וניתן להתאימם לזיהוי של מרבית ה-mRNAs בכל הגנום של העכבר. למרות ששיטה זו מספקת תובנות לגבי דפוסי ביטוי של mRNA במהלך ההתפתחות של מערכת השתן והמין בעובר עכבר, ניתן להחילה גם על מערכות איברים, מינים ושלבי התפתחות אחרים. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית, מכיוון שהטמעה של הרקמה ב-auger עלולה להיות קשה ללמידה, ומכיוון ששינויים קלים באוריינטציה עלולים להוביל לתוצאות לא עקביות. לפחות יום אחד לפני הכנת הרקמה, הסירו והשליכו את הממברנה מפלטת תרבית תאים מסוג milli בקוטר 12 מילימטר; הטבעת שנותרה תשמש כתבנית. השרו את הטבעות למשך לילה בתמיסת מעכב RNAs.

ביום ביצוע הפרוטוקול, בצעו נשף של דרכי השתן והמין התחתונות של עכבר שעבר רהידרציה עם מתנול בדרגות ריכוז משתנות. לאחר שטיפות עם PBS tween, השליכו כשני שלישים מהשלפוחית ואחסנו את רקמת דרכי השתן והמין התחתונות שנותרה ב-PBS tween. כעת, הניחו תבנית טבעת מטופלת על סמידת מיקרוסקופ ומלאו אותה בתמיסת אגרוז (agarose) 4% בעלת נקודת התכה נמוכה בטמפרטורה של 62 °C, והמתינו לקירור במשך כשתי דקות.

כעת, ייבשו את רקמת דרכי השתן והמין התחתונות בשיטת block dry והטבילו אותה בתמיסת ה-arose. השתמשו בפינצטה כדי לכוון את הרקמה כך שתהיה תלויה במרחק שווה בין החלק העליון לתחתון של הטבעת. הדגרימו בתבנית בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס עד שה-arose יתקשה.

לפני חיתוך הרקמה, הכין להב וילקינסון (wilkinson) מותאם אישית על ידי שטיפה בממסים, ולאחר מכן במים. הפר את הלהב הכפול לאורכו לשני להבים בודדים. לאחר מכן, תמוך בלהב הוילקינסון באמצעות להב מיקרוטום.

כדי לעשות זאת, ראשית, חתכו את להב המיקרוטום לאורך של להב הוילקינסון (Wilkinson). לאחר מכן, בעזרת דבק Lock Tite, הדביקו את להב המיקרוטום ללהב הוילקינסון בהיסטה של כ-3 עד 4 מילימטרים מקצה החיתוך. כעת, התקינו את הלהב המחוזק במיקרוטום הרוטט וכווננו את זווית הלהב ל-35 מעלות.

הכינו את אמבט הדגימות המשודרגת על ידי מילוי האמבט ב-PBS והצבת קרח רטוב מסביבה. לפני הצמדת הרקמה הטמיעה בתוך הפקק, הוציאו אותה מתבנית הטבעת וייבשו את המשטח התחתון באמצעות נייר סופג. לאחר מכן, הדביקו את המשטח המיובש לדיסק ההצמדה באמצעות דבק Loctite.

הכניסו את הדיסקה למכשיר החיתוך (vibrator) וכווןו את עובי החיתוך ל-50 microns, את המהירות ל-2 ואת אמפליטוד הלהב ל-4. במהלך חיתוך נתיבי הרקמה, השתמשו בפינצטה קהה כדי להעביר כל נתח לפלטת תרבית בעלת 24 בארות הממולאת בחצי מיליליטר של PBS tween קר במיסוע קרח. לאחר החיתוך, הסירו את רוב ה-aros מסביב לכל נתח רקמה באמצעות מספרי קפיץ לפני תחילת ההיברידיזציה של ה-INI. ניתן לשמור את הנתחים למשך עד 48 שעות בטמפרטורה של 4 °C ב-PBS tween המכיל 2 millimolar sodium azide.

ראשית, הכינו סלי סample מותאמים אישית על ידי חיתוך תחתיתו של מבחנה למיקרו-צנטריפוגה בסימון של 100 µL. חממו את קצה החיתוך של המבחנה בלהבה עד שהפלסטיק יתרכך. לאחר מכן, הצמידו בחוזקה את הפלסטיק הרך לריבוע רשת.

הניחו לזה להתקשות וגזרו את שאריות הרשת. השלימו את הסלסלאות על ידי שימוש במחט 18 gauge מחוממת כדי לקדח שני חורים בכל מכסה של שפופרת. הכינו מגש להחזקת סלסלאות הדגימות על ידי קידוח של 24 חורים בקוטר 12 מילימטר במרווחים שווים במכסה של פלטה בעלת 24 בארות.

יש למקם כל חור ישירות מעל באר לפני תחילת חימום מוקדם של תא היברידיזציה מכוסה, מלא בחצי אינץ' של מי ברז, לטמפרטורה של 60.5 °C. יש להתחיל את ההיברידיזציה in situ על ידי הוספת 2 mL של PBS tween לכל באר בלוח תרבית בעל 24 בארות. כסו לוח זה עם המכסה המוכנה עליה טעונים סלסלאים.

כעת העבירו את חתכי הרקמה לסלסלאות בטמפרטורת החדר עם נדנוד. דגרו את החתכים ב-6% hydrogen peroxide עם PBS tween, ולאחר מכן בצעו סדרת שטיפות עם PBS tween, דגירה עם proteinase K, קיבוע נוסף ושטיפות נוספות. כדי להשלים את הכנת הדגימות, הוסיפו שתי מיליליטר של בופר pre-hybridization לכל באר ודגרו את הפלטה בתוך תא ההכלה (hybridization chamber) המחומם למשך שעה אחת לפחות. התחילו את ההכלה על ידי הוספת 0.5 מיקרוגרם של RIBA Probe מסומן לכל באר.

לאחר מכן, המשיכו בדגירה למשך הלילה בתוך תא ההיברידיזציה המחומם. למחרת, שטפו את הרקמות עם תמיסה אחת תוך מעבר הדרגתי לתמיסה שתיים, ולאחר מכן טפלו ב-RNAs. לאחר מכן שטפו בתמיסה שלוש, ואחריה שטיפות ב-TBS tween ובבופר חסימת רקמות (tissue blocking buffer) בזמן שהרקמות נדגרות בבופר חסימת הרקמות.

התחילו דגירה של לפחות שעתיים עבור הנוגדן anti-dig בבফার ספיגת נוגדנים בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס לאחר תקופת הדגירה. סבבו את תמיסת הנוגדנים ב-10,000 RPM למשך דקה אחת. כדי להסיר חומרים בלתי מסיסים, הוסיפו את ה-Senna לשני מיליליטר של בফার תמיסת נוגדנים.

כעת הוצאו את הרקמה מתוך תמיסת החסימה והדגירו אותה בתמיסת הנוגדנים שהוכנה. השאירו אותה בתא היברידיזציה למשך הלילה בטמפרטורה של 4 °C ביום השלישי של הפרוטוקול. שטפו את הרקמות מספר פעמים ב-TBST עם ה-ole.

לאחר מכן, באמצעות פיפטת פסטה מזכוכית, העבירו בזהירות את הרקמות לתוך מבחנות מיקרו-צנטריפוגה נקיות. שטפו את הרקמות במשך 10 דקות עם מיליליטר אחד של NTM ריק.

לאחר מכן, החליפו את התמיסה ב-TMT המכיל lava sole MBM purple. הניחו את המבחנות בחושך ובמהלך מספר הימים הבאים, עקבו אחר התפתחות הצבע והחליפו את התמיסה לפי הצורך. לאחר התפתחות מלאה של הצבע, שטפו את הרקמות קצרה ב-TMT המכיל lava so ולאחר מכן דגרו אותן למשך הלילה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס ב-PBS המכיל para formaldehyde.

ביום למחרת יש לבהיר ולשטוף את הרקמות. הפרוסות מוכנות כעת לדימוג. רקמת דרכי השתן התחתונה הוטמעה באגר כך שקו האמצע של השופכה היה מקביל למשטח השטוח של פקק ה-aros.

אוריינטציה זו הניבה חתכים סגיטליים. סלי סדמפיות בהתאמה אישית הגנו על חתכי הרקמה העדינים מאבק ומחלקיקים, במהלך הליך ההיברידיזציה ב-C שארך מספר ימים.

הם מנעו בנוסף אובדן של חתכים כלשהם. קשה להגביל את הצביעה הרקעית במהלך הדגירות הממושכות הנדרשות לזיהוי של mRNA בריכוז נמוך. עם זאת, נראה כי הוספה של sodium azide וסינון לאחר מכן הגבילו את הצביעה הרקעית.

יתרה מכך, לא נצפו הבדלים גלויים בצביעת הרקע כאשר הדגימות הובעו בתמיסה לפיתוח צבע לפרקי זמן ממושכים. לאחר רכישת מיומנות, ניתן להשלים טכניקה זו בשישה ימים אם היא מבוצעת כראוי. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שיטות אחרות, כגון immunohistochemistry, כדי לקבוע אם דפוס הביטוי של ה-mRNAs תואם לדפוס הביטוי של החלבונים.

לאחר צפייה בסרטון זה, תרכשו הבנה טובה של האופן שבו ניתן להנחית ויזואלית דפוסי ביטוי של mRNA בדרכי השתן והמין התחתונות של עכבר בשלבי התפתחות.