קביעה מהירה של סף nociceptive תרמי בעכברים סוכרתיים
17 במאי 2012
כאן אנו מתארים הליך אמין ופשוט מהירה כדי לקבוע את הטמפרטורה הנמוכה ביותר שבה חולדות או עכברים מראים התנהגות nocifensive, כלומר סף nociceptive תרמית (TNT). שיטה זו חל גירוי תרמית לאט להגדיל המאפשר הערכה מדויקת לשחזור של TNTs עם מינימום, אם בכלל, הלחץ על בעלי חיים.
המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לקבוע את סף הנוציספציה התרמית של חולדות בקבוצת הביקורת וחולדות סוכרתיות. השלב הראשון הוא הנחת בעל חיים על פלטת החום ההדרגתית ומד האנלגזיה. לאחר מכן, טמפרטורת פלטת החום עולה בהדרגה בזמן שהמשטח מתחמם.
החיה נצפית כדי לוודא שאין התנהגויות של אי-נוחות. כאשר התנהגות זו נצפית, החימום מופסק וטמפרטורת הפלטה באותו רגע נרשמת. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות שינויים בסף הנוציצפטיבבי התרמי בבעלי חיים שטופלו במשככי כאבים או שסובלים מנוירופתיה סוכרתית כרונית.
היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון הלוח החם (hot plate), המוגדר בדרך כלל בטמפרטורה מעל הסף, הוא ששיטותינו מעלות בהדרגה את טמפרטורת הלוח, מה שמאפשר קביעה מדויקת של סף הכאב התרמי (thermal nociceptive threshold). סף הכאב התרמי, או TNT, נקבע באמצעות מד אלגזיה של לוח חם עם עלייה הדרגתית (incremental hot plate analgesia meter), או IH pam. רכיבי מערכת זו כוללים תא תצפית מפלסגלס, לוח אלומיניום עם בקרת טמפרטורה, מקלדת המשמשת לתכנות, ומתג רגל לשליטה מרחוק ביחידה.
הנתונים נאספים באמצעות תוכנה מותאמת במחשב סמוך. לחלופין, ניתן להדפיס עותקים קשיחים באמצעות יציאת טורית הנמצאת ביחידה. הניחו מראה מאחורי תא הפלקסיגלאס כדי להגביר את הנראות של התנהגות בעל החיים.
בשלב הבא, הגדירו את קצבי החימום הרצויים, וכן את טמפרטורת ההמתנה הראשונית ואת טמפרטורת הניתוק הסופית. לחצו על מתג הרגל כדי להפעיל ולעצור את המערכת. ודאו כי טמפרטורת ההמתנה הראשונית וטמפרטורת הניתוק הסופית תועדו, כמו גם הזמן שנדרש להגעה לטמפרטורה הסופית.
אם חפץ, יכול הבחוק לבחון את המערכת על עצמו, על ידי הסרת היד מהלוח המתכתי ברגע תחושת הכאב. התפיסה לא תגרום לנזק לעור ולא תביא לאי-נוחות מאוחרת.
התחילו את תהליך ההסגה בלילה שלפני הבדיקה על ידי הנחת הכלובים על השולחן שבו תתבצע הבדיקה. שעתיים לפני הבדיקה, הפעילו את ה-IH pan כדי להרגיל את בעלי החיים לרעשי הרקע של המכשיר.
בשלב זה, ניתן להגדיר את המערכת ולבדוק אותה כפי שהודגם קודם לכן. לאחר שהחיות הסתגלו לסביבה, מקמו בעדינות חולדה בתוך תא הפלקסיגלס על גבי המשטח החם. אפשרו לבעל החיים לחקור את התא במשך מספר דקות.
התחילו בבדיקה. ברגע שהחיה נראית רגועה מספיק כדי להתחיל בניסוי, לחצו על מתג הרגל כדי להתחיל בחימום הלוח. עקבו אחר התנהגות החיה בזמן חימום הלוח.
בדרך כלל, אנשים שאינם מיומנים בשיטה זו יתקשו בתחילה, כיוון שזיהוי התנהגות התקפית המסיבית אינו תמיד פשוט ומצריך תרגול. התנהגויות שאינן התקפיות מאופיינות בליקוק, ניעור או הרמה של אחד משני הנקבים האחוריים. מועיל לציין כי ההתנהגות הראשונה שניתן להבחין בה עשויה להיות ליקוק של ארבעת הנקבים, ואחריה תגובה של הנקבים האחוריים.
כאשר נצפית התנהגות בעלת רמת הפרעה מרבית, יש ללחוץ על מתג הרגל כדי להפסיק את הניסוי ולהחזיר את החיה לכלוב מגוריה. הטמפרטורה המעוררת התנהגות זו נחשבת כסף הנוציצפטי התרמי או ה-TNT של חיית הביקורת. יש לנקות את היחידה ולחזור על הבדיקה עבור החיה הבאה.
להלן ספי הנוציצפטיביים התרמיים של חולדות ועכברים צעירים ובריאים. הנתונים המוצגים כאן מראים כי ה-TNT של החולדות לא השתנה כאשר הן נבדקו לאורך תקופה של ארבעה ימים. באופן דומה, ה-TNT של העכברים היה עקבי בין גילאים שונים.
בדוגמה זו, נמדדו באופן חוזר ספי thresholds של TN TS בחולדות צעירות עם סוכרת ש प्रेरितה על ידי STZ. ניתן לראות ירידה עקבית בספי הנוציצפטיביים התרמיים החל משבועיים לאחר השראת הסוכרת. כאן, נעשה שימוש ב-IH pam כדי לבחון את התכונות האנטי-נוציצפטיביות האקוטיות של התרכובת האנלגזית.
A, התרכובת הפיקה מאפקט משכך כאבים קל בבעלי חיים בביקורת בהשוואה לאלו שקיבלו נשאי תרופה (vehicles). עם זאת, השכוך היה בולט יותר בבעלי חיים סוכרתיים שקיבלו את התרכובת בהשוואה לביקורת שקיבלה נשאי תרופה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב מאוד לזכור לנטר באופן רציף את התנהגות בעלי החיים, ובמיוחד אותה התנהגות המתרחשת סמוך ל-cept T של בעל החיים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מתאר פרוצדורה פשוטה ואמינה לקביעת סף הנוציספציה התרמי (TNT) בחולדות ועכברים. השיטה כוללת הפעלת גירוי תרמי העולה בהדרגה כדי להעריך במדויק את ה-TNT תוך גרימת מינימום סטרס לבעלי החיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי העצבים
- ניתוח התנהגותי
- נוציצפציה תרמית
רקע
- הבנת התנהגות נוציצפטיבית היא קריטית למחקר כאב.
- סף נוציצפטיבי תרמי הוא מדד מרכזי בהערכת רגישות לכאב.
- שיטות קיימות עלולות לגרום למתח (stress) בבעלי החיים, דבר המשפיע על התוצאות.
- מחקר זה שואף לספק חלופה עם רמת מתח נמוכה יותר.
מטרת המחקר
- לקביעת סף הנוציספציה התרמית בחולדות ביקורת וחולדות סוכרתיות.
- להערכת ההשפעה של משככי כאב על התנהגות נוציספטיבית.
- להערכת שינויים ב-TNT הקשורים לנוירופתיה סוכרתית כואבת.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- הנחת בעל החיים על פלטה חמה בעלת עלייה הדרגתית בטמפרטורה.
- העלאה הדרגתית של טמפרטורת הפלטה החמה.
- תצפית על בעל החיים לאיתור התנהגויות נוציפנסיביות (nocifensive behaviors).
- תיעוד הטמפרטורה שבה נצפתה התנהגות נוציפנסיבית.
תוצאות עיקריות
- מדידה מדויקת של TNT תוך הפעלת מינימום לחץ על בעלי החיים.
- יכולת לגילוי שינויים ב-TNT כתוצאה מטיפול אנאלגטי.
- תובנות לגבי השפעותיה של נוירופתיה סוכרתית על רגישות לכאב.
- הדירות של התוצאות לאורך ניסויים שונים.
מסקנות
- השיטה מספקת הערכה מהימנה של ספי תגובה נוציצפטיבית תרמית.
- ניתן להשתמש בה להערכת היעילות של אסטרטגיות לניהול כאב.
- גישה זו משפרת את ההבנה של מנגנוני כאב במודלים של בעלי חיים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מדידה מדויקת של סף nociceptive תרמי (TNT) מאפשרת הערכה אובייקטיבית של רגישות לכאב במודלים פרה-קליניים של נוירופתיה סוכרתית, ובכך תומכת בתיקוף של מטרות טיפוליות ובבדיקת יעילות של חומרי אלחוש. השחזוריות של השיטה והרגישות שלה למצבים של היפראלגזיה מספקות ביטחון ניבוי להפחתת סיכונים של מועמדים לאלחוש לפני המעבר לשלבי מחקר מאוחרים יותר. גישה זו נותנת מענה לאתגר מרכזי במחקר הכאב על ידי אספקת נקודת סיום כמותית ובעלת רלוונטיות תרגומית להערכה מכניסטית וטיפולית.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות הקשורות למסלולי כאב והסרת סיכונים מכניסטיים של מטרות המעורבות ב-thermal hyperalgesia.
- ערך תפעולי: מספק מדד כמותי רגיש להערכת מעורבות המטרה (target engagement) במודלים של נוירופתיה סוכרתית.
- ערך ניבוי: תומך במיון הפורטפוליו על ידי זיהוי שינויים ב-TNT הקשורים לטיפול משככי כאבים, ובכך מסייע בקבלת החלטות של go/no-go.
סקר ופיתוח בדיקה
- מוכנות הבדיקה: מבססת פלטפורמה סטנדרטית וניתנת לשחזור להערכת השפעות של תרכובות על נוציספציה תרמית.
- פלט כמותי: מייצרת מדידות TNT רציפות המאפשרות ניתוח תגובה-מנה ודירוג תרכובות.
- יכולת הרחבה: תואמת לבדיקות בסביבה של תפוקה גבוהה הודות לפרוטוקולים אוטומטיים של העלאת טמפרטורה ותצפית התנהגותית.
מחקר תרגומי ופרקליני
- רלוונטיות למחלה: ממדל באופן ישיר היפראלגזיה בנוירופתיה סוכרתית כואבת, תסמין מרכזי של PDN.
- המשכיות תרגומית: מגשר בין שלב הגילוי לאימות פרה-קליני על ידי אספקת מדד רגישות לכאב שמור בין מינים שונים.
- קידום מותאם סיכון: תומך בקבלת החלטות אובייקטיבית לגבי התקדמות תרכובות בהתבסס על שינויים ב-TNT בבעלי חיים סוכרתיים לעומת קבוצת ביקורת.
שילוב של תהליכי עבודה וצינור עיבוד
השיטה משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף המטרה, דרך זיהוי מובילים ועד לבדיקת יעילות פרה-קלינית, במיוחד עבור תוכניות למערכת העצבים המרכזית (CNS) ואנלגזיה המתמקדות בכאב נוירופתי.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות לגבי מסלולים נוציצפטיביים ובצמצום סיכונים ביולוגיים של מטרות המעורבות בהיפראלגזיה סוכרתית.
- סריקה: מספק נתוני רגישות תרמית הניתנים לשחזור ומוכנים לבדיקה עבור קמפיינים של סריקת תרכובות.
- אנליטיקה: מייצר ערכי TNT כמותיים המאפשרים השוואה סטטיסטית של יעילות אנלגזיה והתקדמות נוירופתיה.
- מחקר תרגומי: עולה בקנה אחד עם אסטרטגיות של סמנים ביולוגיים על ידי אספקת מתאם תפקודי של רגישות לכאב במודלים סוכרתיים.
- שימוש חוזר ארגוני: משמש כפלטפורמה רב-פעמית עבור תוכניות לגילוי תרופות משככות כאבים הדורשות מדידה אובייקטיבית של נקודת קצה של כאב.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי באישור המטרה על ידי הפחתת העמימות המכנית בוויסות נתיבי כאב.
- ערך תפעולי: מבטיח סטנדרטיזציה והדירות בין מעבדות ואתרי מחקר.
- ערך אסטרטגי: משפר את יעילות ההון על ידי מתן אפשרות לזיהוי מוקדם יותר של משככי כאבים לא יעילים באמצעות זיהוי רגיש של TNT.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של תרכובות מותאם סיכונים, בהתבסס על השפעות מוכחות במודלים של נוירופתיה סוכרתית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במדעי המוח ההתנהגותיים ובזיהוי התנהגות נוציפנסיבית (nocifensive behavior).
- תלוי במדד אנלגזיה של פלטה חמה עם עלייה מדורגת ומכוילת ובמערכות בקרת טמפרטורה.
- מחייב הכשרה סטנדרטית של הצופה כדי להבטיח זיהוי עקבי של תגובות נוציפנסיביות.
- כולל פרוטוקולי הסתגלות להפחתת סטרס סביבתי ושונות בערכי הבסיס.
- מוגבל למודאליות תרמית; אינו מעריך נוציספציה מכנית או כימית ללא בדיקות משלימות.
