שיטות מקומיים וכלל עולמיים של הערכת Nociception תרמי ב

המטרה הכוללת של הניסוי הבא היא לבחון נוציספציה תרמית בזחלי דרוזופילה. זאת מושג על ידי איסוף זחלי דרוזופילה ולאחר מכן חשיפתם לגירויים תרמיים מזיקים. כשלב שני רשות, ניתן להקרין את הזחלים ב-UV, דבר הגורם לנזק לרקמה ולרגישות נוציספטיבית תרמית. לאחר מכן, ניתן לבחון את הזחל באופן מקומי באמצעות גשש חום או באופן גלובלי באמצעות פלטת חימום, כדי לעורר תגובות נוציספטיביות שניתן למדוד באופן כמותי.

גשש החום מראה כי לזחלים יש תקרת גג לתגובה הנוציצפטיבית לחום, וקשר מפתיע בין טמפרטורת הקלט לבין עוצמת התגובה שהושרה. בדיקת פלטת החום מראה כי זחלים מציגים רצף סטריאוטיפי של התנהגויות נוציצפטיביות התלויות בטמפרטורת המים שמסביב ובפעילותם של הנוירונים התחושתיים הנוציצפטיביים. השיטות המתוארות כאן יכולות לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בתחום הנוציצפציה התרמית, כגון האם בעלי חיים מגיבים באופן שונה לגירויים תרמיים מזיקים המוצגים באופן מקומי או גלובלי.

בדרך כלל, אנשים שאינם מנוסים בבדיקת גשש החום יתקשו בתחילה, שכן השליטה בבדיקה דורשת תרגול כדי למזער את השונות בלחץ, במיקום ובזווית ההנחה של הגשש. הדגמה חזותית של בדיקת פלטת החום היא קריטית, כיוון שכדי להבין באופן מיטבי את ההתנהגויות המופעלות עם עליית הטמפרטורה, יש לראותן. כדי להשיג מספר מספיק של זחלי דור הבא מגנוטיפ מוגדר מתוך עניין, גידלו את המאוכלוסייה הרצויה באופן ישיר או בצעו הכלאות בבקבוקים המכילים מזון לזבובים, תוך שימוש ב-20 עד 30 נקבות בתולות וב-15 עד 20 זכרים. חמישה ימים לאחר הנחת הביצים, קצרו ונקו זחלי גיל שלישי מוקדם על ידי הוצאת מזון הזבובים הרך וסינון תחת זרם עדין של מים דרך רשת בעלת גודל נקבים של 630 micron. העבירו את זחלי הגיל השלישי המוקדם לרפידה קטנה ולחה של מזון כדי למנוע רעב והתייבשות.

לאחר בניית תא ההרגעה, השתמשו בפינצטה או במברשת צבע כדי להניח בעדינות 10 זחלים בשלב השלישי המוקדם לאורך החלק הפנימי של המכסה וסגרו אותו. בעבודה תחת מapay, הניחו את תא ההרגעה בתוך צנצנת חיבור המכילה כלי מדידה של 10 מיליליטר עם פתיל צמר ספוג ב-1.5 מיליליטר של dathyl ether. הברגו את מכסה צנצנת החיבור כדי לחשוף את הזחלים לאדי האתר למשך 2 עד 2.5 דקות.

לאחר ההרדמה, הוצא את תא ההרדמה מצנצנת ה-Coplan והמתן מספר שניות בתוך המנדף עד לפיזור שאריות אדי האתר. השתמש בבקבוק התזת מים כדי לשטוף בעדינות את הזחלים מתא ההרדמה אל תוך צלחת פטרי קטנה. ייבש את הזחלים המורדמים באמצעות נייר סופג, ולאחר מכן הצמד אותם בעדינות כאשר הצד הגבי פונה כלפי מעלה על רצועת סרט הדבקה דו-צדדי המקובעת לזכוכית של תג מיקרוסקופ בגודל של שלושה על אינץ' אחד.

הניחו את השקופית על המשטח התחתון של תא הקרנה ב-UV וחשפו את הזחלים לאור UV למשך שש שניות בעוצמה של 20 millijoules per centimeter squared. לאחר ההקרנה, טבלו את השקופית במים כדי להצוף בעדינות את הזחלים מהסרט ההדבקה הדו-צדדי. השתמשו בפינצטה או במברשת צבע כדי להעביר בעדינות את הזחלים שהוקרנו לתוך מכל של 15 by 45 millimeter.

מבחנה מזכוכית בנפח דרם אחד המכילה מיליליטר אחד של מזון לזבובים, להשבחה למשך שמונה עד 24 שעות בטמפרטורה של 25 degrees Celsius או בטמפרטורת התרבית הרצויה לפני ההחזרה למארח. עבור בדיקות נוציפציה תרמית, הגדירו תחילה את טמפרטורת הגשש התרמי לנקודת היעד הרצויה. השתמשו במברשת צבע או בפינצטה כדי להעביר בעדינות זחל בודד אל פלטפורמה שטוחה, תוך וידוא שהזחל מכוסה בשכבה דקה של מים.

על מנת למזער את השונות בלחץ וכן להבטיח את המיקום והזווית הנכונים של גשש החום, תרגול הוא המפתח להצלחה. לחצו בעדינות את קצה הגשש כנגד הלרווה בפלח A 4, תוך הפעלת לחץ קל כאשר קצה הגשש נמצא בזווית של כ-45 מעלות בין הגשש לפני השטח של הלרווה. הלחץ אמור לגרום לשקיעה קלה על פני השטח של הלרווה ובדרך כלל יספיק כדי למנוע תנועה.

המשיכו לגרות את הזחלים עד להופעת תגובת נסיגה או עד להגעה לנקודת החיתוך ה-22. זחלים המגיבים מפגינים בדרך כלל תחילה התנהגות מקדימה של הרמת הראש והזנב, ואחריה התנהגות נסיגה של גלגול של לפחות 360 מעלות. ברגע שהתנהגות הנסיגה החלה, הפסיקו את המגע עם הפרובה ורשמו את השיהוי או את הזמן שנדרש לנסיגה.

אם לא נצפתה התנהגות נסיגה תוך 20 שניות, הזחל נחשב כמי שאינו מגיב. מקמו את סיבי ההולכה של האור האופטי כדי להבטיח תאורה מספקת בעלת ניגודיות גבוהה. לצורך צפייה בזחלים, הכניסו את גוש החימום לתוך פלטת החימום כאשר הצד השטוח פונה כלפי מעלה, ולאחר מכן הניחו את פלטת החימום על בסיס המיקרוסקופ.

הפעילו את לוח החימום על הגדרה גבוהה והמתינו כ-15 דקות עד שהטמפרטורה תתייצב על 95 °C. מדדו 80 µL של מים מזוקקים והניחו את טיפת המים במרכזה של צלחת פטרי מפוליסטירן בגודל 60 על 15 מילימטר באמצעות מיקרופיפטה. השתמשו בפינצטה כדי להניח בעדינות זחל נקי בשלב גוזל שלישי (mid third instar) למרכז טיפת המים, תוך הכנסת כמות מינימלית של מים נוספים.

הניחו בעדינות את פטרי הפטרי על גבי בלוק החימום המוצק שעל פלטת החימום. כווןו במהירות את מיקום הכלי כך שהזחלים כולם וטיפת המים יהיו בשדה הראייה. הפעילו את הטיימר.

בשלב זה, מניחים את צלחת הפטרי על גבי בלוק החימום המוצק של פלטת החימום ומתעדים את זמן תחילתו של כל התנהגות. חמש. התנהגויות לוקומוטוריות סטריאוטיפיות נצפות עם העברת הזחל הטבול במים אל פלטת החימום. התנהגות נורמלית בהיעדר חום כוללת לוקומוציה מסוג parasol, הנלווית לתנועות ראש של חיפוש.

התנהגות של רעידת ראש (Head thrash) עשויה להתרחש בשלב הבא, כאשר הלרבה מניעה את ראשה במהירות בתנועה קדימה או הצידה. תנועה זו דומה לתנועתם הרגילה במים, אך היא מתרחשת באופן קטוע ועקבי יותר תוך כדי גלגול. התנהגות זו נרשמת כאשר הלרבה מתגלגלת הצידה לפחות 360 מעלות מלאות.

דבר זה עשוי להתרחש מספר משתנה של פעמים ולעתים כולל גלגולים חלקיים. לצורך דירוג ההתנהגות, ספרו רק גלגולים מלאים של 360 מעלות. התנהגות זו היא הדומית ביותר לסצנה שבה מיושם גשש חום מקומי במהלך התנהגות שוט (whip behavior).

הזחל מראה תנועות כיווץ ושחרור מהירות לאורך הציר הקדמי-אחורי, המביאות את הראש קרוב מאוד לזנב לזמן קצר מאוד. תנועות צליפה נצפות לעיתים קרובות ברצף מהיר, או במקביל לתנועות גלגול. לבסוף, הזחל יראה התנהגות של פרכוסים, שלעיתים קרובות אחריהם שיתוק. במהלך התנהגות הפרכוסים, הזחל נמתח לאורך הציר הקדמי-אחורי ומראה רעידות בתדירות גבוהה של כל הגוף.

התנהגות רעידה ללא שיתוק כפיפה מתרחשת כאשר הזחלים מפסיקים לנוע. בחלק מהזחלים מצב זה הוא קבוע, בעוד שאחרים מפגינים לאחר מכן תנועת פעימה בתדר נמוך. בגרף זה של אחוזי המגיבים השייכים לכל קטגוריה, ניתן לראות תקרת מקסימום לתגובת הנוספציה התרמית של הזחלים. בבדיקת גשש החום, 100% מהזחלים הם מגיבים מהירים עד לטמפרטורת גשש של 52 °C.

עם זאת, בטמפרטורה של 54 °C ומעלה, 90% או יותר מהזחלים אינם מגיבים אפילו לאחר 20 שניות של מגע. למרות שזחלים אלו ממשיכים לנוע לאחר נקודת החיתוך ה-22, ניתן למדוד ולשרטט גם את מספר הגלגולים או את הזמן שהוקדש להתנהגות נסיגה של סלידה. באופן מפתיע, נראה כי קיים קשר הפוך בין טמפרטורת הכניסה של הגשש לבין עוצמת התגובה, שכן טמפרטורות נמוכות יותר נראות כמעוררות מספר רב יותר של גלגולים.

חמש התנהגויות תנועה סטריאוטיפיות נצפות בעת העברה של הזחל הטבול במים ללוחית החימום. זמני השהייה הממוצעים שבהם נצפו התנהגויות אלו מוצגים כאן, וכך גם טמפרטורות טיפות המים הממוצעות שנמדדו עבור כל זמן שהייה בתנאי הבדיקה האופטימליים המוצגים כאן; אחוז הזחלים שהפגינו כל התנהגות נפרדת נע בין 77% ל-100%, אם כי לעיתים התנהגויות הגלגול והצליפה מושמטות, חופפות או מתרחשות בסדר הפוך. אחוז הזחלים שנישרו לאחר תחילת התנהגות השיתוק בבדיקת לוחית החימום מוצג כאן. הזחלים חוממו עד לשיתוק ואז הועברו לתנאי תרבית סטנדרטיים כדי להתאושש.

הזחלים שקיבלו טיפול דמה (mock) עברו טיפול זהה למעט החשיפה לחום, והיצירה של PPE בבוגרים חיים נמדדה כמותית ביום השביעי עד ה-13. כאן, MD G four מניע ביטוי של טרנסגנים המוסדרים על ידי UAS בכל ארבעת הסוגים של נוירונים תחושתיים פריפריים מולטי-דנדריטיים. UAS or one delta C מבטא גרסה משופרת של תעלת אשלגן פתוחה (open rectifier potassium channel) של דרוזופילה, הדרושה להעברה סינפטית, ו-UAS orrc one delta NC מבטא גרסה משופרת נוספת של אותה תעלה, שאינה מפריעה להעברה סינפטית.

שימו לב שרק זחלים הנושאים הן את הדרייבר MD GALF four והן את הטרנסגן UAS ORC one delta C מראים השהיות מוגברות בארבעה מחמשת ההתנהגויות שנצפו. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיו בעלי הבנה טובה לגבי אופן מדידת התגובות המקומיות והגלובליות של זחלי GEs לגירויים תרמיים מזיקים. ניתן לשלב הליכים אלה עם שיטות אחרות, כגון ניתוח גנטי, כדי לזהות את הגנים הדרושים לנוציצפציה תרמית. בעת ביצוע בדיקת הגשש התרמי, חשוב לזכור למזער את השונות בלחץ, במיקום ובזווית המגע של הגשש.