במרחב ובזמן מניפולציה של פעילות GTPase קטן ברמת subcellular ועל לוח זמנים של שניות בתאים חיים

סרטון זה מדגים שיטה שבה נעשה שימוש באור UV כדי לשלוט בפעילות של חלבון בממברנת הפלזמה. לשם כך, תאיים עוברים קו-טרנספקציה של חלבון FRB מעוגן לממברנה ושל חלבון העניין המחובר ל-FKBP. נגזרת של rapamycin עם "כלוב פוטוני" (photo-caged) מתווספת למצע.

לאחר מכן, במהלך דימות של תאים חיים, מופעל אור UV על אזור ספציפי בתא. המקשר (linker) בין ה-rapamycin ל-biotin נשבר, ובכך משתחרר הדימריזר הכימי ותוצר הלוואי שלו; הדימריזר המשוחרר מפיץ את עצמו לתוך התאים ומשרה דימריזציה בין החלבון הנחקר המסומן ב-FKBP לבין FRB המעוגן לממברנת הפלזמה באזור שהוקרן. ללא קרינת ה-UV, ה-FKBP וה-FRB אינם נקשרים, ולכן לא נוצר אפקט.

ניתוח הנתונים חושף גיוס ממוקד מאוד של החלבון המותאם של ה-FKBP בהתבסס על השפעתו הפיזיולוגית. היתרון של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון גישות פרמקולוגיות וגנטיות, הוא השילוב של מהירות פעולה, ספציפיות למטרה ורזולוציה מרחבית. ההשלכות של טכניקה זו נשמרות כלפי טיפול במטסטזות של סרטן, שהן תוצאה של נדידה של תאי סרטן.

לפיכך, מניפולציה של פעילותם של גורמי נדידה מרכזיים עשויה לחשוף את המנגנון המולקולרי המדויק שלהם, המהווה תנאי מוקדם לטיפול ולריפוי. את הפרוצדורה ידגימו כריס פול מאייר, סטודנט לתואר מתקדמים, ובוב דה רוז, טכנאי מהמעבדה שלי. התחילו את הפרוטוקול על ידי ערבוב של הרכיבים הבאים באבוב מיקרו-צנטריפוגה סטרילי: פלסמיד, DNA, FRB המעוגן לממברנה, FKBP מסומן פלואורסצנטית, TIA one ומים דה-יוניים; הוסיפו לתערובת 1 µL של a few gene HD וערבבו במכשיר וורטקס.

דגרו את המבחנה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. במהלך הדגירה, הוסיפו 50 µL של poly-D-lysine לכל באער בתא זכוכית בעל שמונה באערים ודגרו למשך דקה אחת כדי לצפות את פני השטח, לאחר מכן שאבו את התמיסה ושטפו את מרכז כל באער עם 50 µL של מים דה-יוניים. לאחר מכן, בצעו trypsinization לתאי NIH 3T3 בהסמיכות של 80% עד 85%.

לאחר ניתוק התאים, הוסיפו 10 milliliters של DMEM המכיל 10%FBS, העבירו 375 microliters מהסספנזיה למבחנה סטרילית של 15 milliliter וסובבו בצנטריפוגה ב-1, 500 G למשך שלוש דקות. לאחר הסבוב, שאבו בזהירות את המדיום. הוסיפו 750 microliters של DMEM עם 10%FVS ובצעו Resus.

שחזר את המשקע על ידי פיפוט עדין למעלה ולמטה מספר פעמים. לבסוף, הוסף את תרחיף התאים לתמיסת הטרנספקציה ובאמצעות קצה הפיפט ערבב בעדינות; הוסף 250 microliters של תרחיף טרנספקציית התאים לכל באער בתא. החלק והדגר את התא.

37 °C למשך 15 עד 18 שעות. כדי לסנתז cage rapamycin, biotin adduct. התחל בהכנת תמיסת סטוק של CRB בריכוז 1 mM ב-DMSO בתוך מבחנה סטרילית לצנטריפוגה. במבחנה נפרדת של 1.5 ml, המס 1 mg של avadon ב-250 µL של PBS.

בשלב הבא נבצע צימוד (conjugation) של קבוצת הכלוא (caging moiety) לראפמיצין. יש להוסיף 0.5 µL של תמיסת הסטוק של CRB ל-AVID המומס, לערבב על ידי הפיכה של המבחנה מספר פעמים ולאחר מכן לדגור בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. כדי להפיק תמיסת צימוד של CRB AVID, להסיר מולקולות קטנות שאינן קשורות ולטהר את CRBA, יש להש equilibration של עמודת הפרדה גודלית G 25 באמצעות 300 µL של PBS.

חזור על הפעולה חמש פעמים לאחר שהעמודה הגיעה לשיווי משקל. טען 125 µL של תמיסת CRBA למרכז מיטת העמודה. לאחר מכן, סבב את התמיסמה למטה במשך שתי דקות ב-800 G בטמפרטורת החדר, ואסוף את הנוזל שעבר (flow through) לשפופרת מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 mL לאחר ביצוע הטרנספקציה של התאים.

החלף את המצע ל-DMEM ללא FBS כדי להרעיב את התאים בסרום והדגר למשך 12 שעות. לאחר ההדגרה, שאב בעדינות את המצע והוסף 250 µL של תמיסת CRBA בריכוז 1 µM שהוכנה מראש. לאחר מכן, כדי להדמיא את הדינמיקה של החלבונים בתאים חיים, השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי עם דיסקה מסתובבת (spinning disc) בעל תאורה ב-UV, עם אופטיקה המותאמת לנורת UV LED באורך גל של 365 nm.

באמצעות תאורת פלואורסצנציה אפיפוסקופית. הגדירו את הקואורדינאטות ואת גודל נקודת ההארה באמצעות פלטת זכוכית מצופה בצבעים פלואורסצנטיים המעוררים על ידי אור UV. פעולה זו מאפשרת כיוון עדין של השטח שיוקרן.

הניחו את למסלייד התא עם התאים על הבמה תוך שימוש בעדשה של 100x ובפלואורסצנציית epi. התאימו את התאים לפוקוס ואתרו תא בודד. לצורך הדמיה, התחילו בהדמיית התאים לאחר קביעת רמות הרקע של ההשפעה הפיזיולוגית.

כאן, נמדד הקימוט של הממברנה (membrane ruffling) באמצעות הקרנת אור UV ברבע אחד נבחר של התא, כדי לשחרר את ה-rapamycin הכלוא; המיסו את ה-rapamycin המקורי ב-DMSO ולאחר מכן ב-PBS לריכוז סופי של 400 nanomolar. הוסיפו 100 microliters של התמיסה לתא הדמיון כדי להשרות השפעות גלובליות. צלמו תמונות פלואורסצנציה כל 15 seconds למשך 20 minutes כדי לקבוע האם הפעלה מקומית של RAC יכולה להשרות יצירה מקומית של קימוטים.

תאי NIH 3T3 עברו טרנספקציה של RAC activator FKbp המסומן ב-YFP, TIA1 ו-LDR, המעוגן לממברנה. הקרנה ממוקדת של FRB בשולי התא, כפי שמסומן בעיגול הצהוב, לאחר מכן בוצעה הארה גלובלית באמצעות מנורת כספית למשך שנייה אחת, החל מהשנייה ה-1063. כפי שניתן לראות כאן, כמעט ולא נצפתה התקפלות ממברנה (membrane ruffling) בהתחלה.

עם זאת, בעקבות הארה מקומית נצפתה התקפלות (ruffling) מוגבלת מרחבית; לאחר הארה גלובלית והוספת rapamycin, הגורמת לתעתוק של FK bp TIA one לממברנת הפלזמה, נצפתה התקפלות גלובלית בתא. הדבר מעיד על כך שההתקפלות המקומית שנצפתה קודם לכן נגרמה מהפעלה של rack המוגבלת מרחבית. לצורך ניתוח כמותי, תאי המטרה חולקו לארבעה רבעים, ותדירות היווצרות ההתקפלות בכל רבע בעקבות גירוי מקומי וכן בעקבות גירוי גלובלי נקבעה, כפי שניתן לראות בגרף זה.

אף אחד מהתאים שנצפו לא הראה היווצרות של רפלים (ruffles) עם CRBA ללא הקרנת UV או עם הקרנת UV מקומית, עם או בלי Aden בתווך כללי (bulk medium). עם זאת, כאשר נוסף CRBA ובוצעה הקרנת UV, נצפתה היווצרות רפלים בשיעור דומה של כ-90% בכל הרבעים בעת הקרנה גלובלית; כאשר רק רבע אחד הוקרן, שכיחות היווצרות הרפלים הייתה 100% בהשוואה ל-30%, 25% ו-30% ברבעים שני עד רביעי. תוצאות אלו מעידות כי ניתן להשתמש בשחרור מקומי (uncaging) של rapamycin כדי להשרות השפעות פיזיולוגיות ממוקדות מאוד בתא בודד.

במקרה זה, קימטוט ממברנה (membrane ruffling) שנגרם על ידי הפעלת rack. לאחר צפייה בסרטון זה, תגמירו להבנה טובה של האופן שבו ניתן להשיג בקרה מרחבית-זמנית של פעילות small GTPases באמצעות אור. ניתן ליישם שיטה זו על כל תהליך פיזיולוגי התלוי בתעתוק של חלבונים ספציפיים לממברנת הפלזמה.

בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור להכין תמיסות, ריאגנטים ותאים טריים עבור כל הליך. זכרו כי עבודה עם אור UV עלולה להיות מסוכנת ביותר ויש להקפיד תמיד על נקיטת אמצעי זהירות, כגון הרכבת משקפי UV.