מתא בודד ניתוח בצילוס subtilis Biofilms באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ו cytometry זרימה

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להדגים ולכמת תתי-אוכלוסיות נפרדות של תאים ייעודיים המבדילים את עצמם בביופילמים של אורגניזם המודל, bacillus subtiles. הדבר מושג תחילה על ידי הכנסת רפורטרים תעתוקיים לכרומוזום של B subtles. רפורטרים אלו יבואו לידי ביטוי באופן בלעדי בתת-האוכלוסייה של התאים הנחקרים.

השלב הבא הוא לעודד התפתחות של ביופילם על ידי גידול של B subtles במצע המשרה ביופילם, Ms GG gg. לאחר היווצרות הביופילם, התאים מהביופילם מפוזרים ומקובעים באמצעות para formaldehyde. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא זיהוי אות הפלואורסצנציה הנפלט מתאים בודדים של הקהילה המיקרוביאלית באמצעות מיקרוסקופיית פלואורסצנציה וציטומטריה של זרימה.

בסופו של דבר, התוצאות מראות כיצד תאים התמחו בייצור והפרשה. המטריצה החוץ-תאית המרכיבה את הביופילם נוצרה על ידי תת-אוכלוסייה שונה מאותם תאים המפרישים סורפקטנט, המולקולה המאותתת האחראית על ההבחנה של תת-האוכלוסייה של יצרי המטריצה. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון כימות ביטוי שעתוק באמצעות בדיקות Viability או אנליזת מיקרו-מערך (microarray), הוא שהיא מאפשרת לנו לנטר ביטוי גנים ברמת התא הבודד ולהציג ויזואלית אוכלוסיות תאים קטנות במיוחד שהתמחו בביטוי של גן ספציפי.

ביטויים גנתיים אלה לא יזוהו בעת ניתוח האוכלוסייה הכללית. פלסמידים אינטגרטיביים משמשים לסימון B subtles ודוגמה לכך מוצגת כאן. PTAA, הפרומוטור של הגנים האחראים לייצור tass.

חלבון מטריקס משוכפל לתוך הווקטור באמצעות אתרי ההגבלה ECO R one ו-Hindi three. ביטוי הגן המדווח CFP נמצא כעת תחת בקרתו של ptap A. כדי להתחיל את הליך הסימון של B, subtles, יש לבצע ליניאריזציה לפלסמיד האינטגרטיבי באמצעות עיכול אנזימטי. האנזים להגבלה המומלץ הוא XH oh one. כאשר הפלסמיד האינטגרטיבי מוכן, יש להשרות כשירות טבעית (natural competence) בזן 1 68 של B subtlest על ידי גידול התאים במצע להשראת כשירות למשך חמש שעות ב-37 °C.

הוסיפו את הפלסמיד הלינארי לתרבית של תאי B subtilis כשירים (competent) והדגרימו למשך שעתיים ב-37 degrees Celsius. לאחר שעתיים, זרעו את התאים על מצע אגר עם spectinomycin והדגרימו למשך לילה ב-37 degrees Celsius. לכרומוזום של B subtilis יש שני לוקוסים ניטרליים, Amy E ו-LAC A, שניתן להשתמש בהם להטמעת איחורי דגיש (reporter fusions) מבלי להשפיע על התפתחות הביו-פילם. הפלסמיד PKM 0 0 8 הלינארי נטמע בגנום של B subtilis על ידי רקומינציה כפולה.

השלב הבא הוא להעביר את הרפורטר מהזן המסומן לזן המסוגל להוות ביופילמים באמצעות פרוטוקול טרנסדוקציית פאג SPP one. לצורך סרטון זה, מוצגים רק השלבים החשובים בפרוטוקול. גדלו את זן התורם 1 68, הנושא את היתוך הרפורטר, במצע TY בטמפרטורה של 37 °C עד שהתרבית מגיעה לשלב סטציונרי מוקדם, בנפח של 200 µL תאים ל-100 µL של מלאי פאג מהול בתוך מבחנה מזכוכית.

נמתין בטמפרטורה של 37 °C למשך 15 דקות. לאחר מכן, נעביר באמצעות פיפטה אגר רך מסוג TY חם אל המבחנה ונערב היטב באמצעות וורטקס. נמרח בעדינות על פלטת TY טריה ונדגיר בטמפרטורה של 37 °C למשך שמונה עד 16 שעות כדי לאפשר להופעת הילות של פאג'ים.

כדי לאסוף את הילה של הפאג'ים, הוסיפו שלושה מיליליטרים של מצע TY לצלחת והשתמשו בפיפטת זכוכית כדי לפרק את שכבת האגר העליונה. העבירו את תרחיף האגר לנבובת פלקון של 15 מיליליטר. ערבבו בעדינות במערבל וורטקס כדי לפרק את האגר, ולאחר מכן סנטריגו ב-1000 G למשך 15 דקות.

העבירו את הנוזל העליון למבחנה חדשה. העבירו את הנוזל העליון דרך מסנן מזרק של 22 מיקרון. השתמשו בנוזל עליון זה כדי להדביק תרבית של זן המקבל שגודלה במצע TY.

הוסיפו 30 µL של על-נוזל (supernatant) ל-10 mL של תרבית המדוללת ביחס של 1:10, והדגירו למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 °C. לאחר מכן, סבבבבו בצנטריפוגה במהירות של 5,000 RPM למשך שבע דקות, השעיקו מחדש את המשקע ב-200 µL של מצע TY והפריסו על צלחת המכילה SPECTmycin בתוספת 10 mM של נתרן ציטראט.

דגרו בטמפרטורה של 37 °C למשך 12 עד 36 שעות. בחרו מושבה וגדלו אותה במהלך הלילה במצע LB נוזלי בטמפרטורה של 37 °C. לבסוף, טפטפו 3 µL מהתרבית שגדלה במהלך הלילה על מצע מוצק המעודד יצירת ביופילם.

אפשרו לתאים לצמוח במשך 72 שעות בטמפרטורה של 30 degrees Celsius. לאחר שלושה ימי צמיחה, ביופילמים שנוצרו על פני הגאר של Ms.GG יפתחו ארכיטקטורה מורפולוגית מורכבת על פני הגאר. כדי להתחיל בפרוצדורה זו, השתמשו בקיסם שיניים או בפינצטה כדי להסיר את הביופילם מפני הגאר של MSGG.

עקביות הביופילם צריכה לאפשר את קלופו מפני השטח של האגר. העבר את הביופילם כיחידה אחת לשלושה מיליליטר של PBS buffer, ופזר את הביופילם בעדינות. בצע 12 פולסים עם output של שלושה ואמפליטודה של 0.7 שניות כדי לקבע את הדגימות לפני ניתוח של תא בודד.

השעה מחדש 300 µL של תרחיף התאים ב-1 mL של תמיסת פאראפורמאלדהיד 4%, והדגר בטמפרטורת החדר למשך שבע דקות בדיוק. לאחר קיבוע של שבע דקות, שטוף את התאים במערך PBS שלוש פעמים. לבסוף, השעה מחדש את התאים ב-300 µL של באפר PBS לפני מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

הכינו זכוכית למסך מיקרוסקופ על ידי טפטוף של 200 µL של 0.8% agros על גבי הזכוכית, וכסו אותה בזהירות עם זכוכית נוספת. לאחר שתי דקות, הסירו בעדינות את הזכוכית העליונה כדי לקבל שכבה של agros הדבקה לזכוכית התחתונה. טפטפו 2 µL של תאים מקובעים על פני השטח של שכבת ה-agros וכסו אותה עם זכוכית כיסוי למסך מיקרוסקופ.

הנח את הדגימה על השולחן של מיקרוסקופ הפלואורסצנציה. קבע את זמן העירור בהתאם לבקרת שלילה שאינה מראה פלואורסצנציה בתנאים שנבחרו עבור הניסוי. זמן החשיפה צריך להיות בין 50 ל-200 milliseconds.

רכשו תמונה פלואורסצנטית וכן תמונת שדה בהיר עבור כל שדה ראייה. כדי להכין את התאים לניתוח בציטומטריה של זרימה, פזרו את דגימת התאים המקובעים באמצעות סוניקציה עדינה. בצעו שתי סדרות של 12 פולסים עם הספק של חמישה ואמפליטודה של 0.7 שניות כדי לפרק גושים לתאים בודדים מבלי לגרום לליזיס של התאים.

יש לאשר את יעילות פיזור התאים באמצעות מיקרוסקופיה של אור. לאחר מכן, יש לדלל את הדגימה ביחס של 1:100 בבופר PBS. לניתוח של פלואורסצנציית YFP ייעשה שימוש במכשיר BD FACSCanto II flow cytometer.

עירור בלייזר באורך גל של 488 ננומטר, בשילוב עם מסנן 5 30 30, משמש עבור פלורסצנציית CFP. עירור בלייזר באורך גל של 405 ננומטר, בשילוב עם מסנן 4 0 8 40, משמש לכיול ציטומטר הזרימה באמצעות שתי בקרות שליליות. דגימה של תמיפת PBS ללא תאים בסספנסיה תשמש כבקרה שלילית לגודל החלקיקים המזוהים על ידי ציטומטר הזרימה.

דגימה ללא מדד פלואורסצנטי (fluorescent reporter) צריכה לשמש כביקורת שלילית לרגישות הפלואורסצנטית של ציטומטר הזרימה. לאחר הכיול, מקבלים את הדגימה המסומנת במדד פלואורסצנטי לתוך ציטומטר הזרימה; עבור כל דגימה, מנתחים לפחות 50,000 אירועים (events) בקצב זרימה של עד 30,000 אירועים לשנייה. כאשר B Subtles גדל על צלחת של מצע המשרה היווצרות ביופילם, MSGG, נצפית היווצרות ביופילם לאחר שלושה ימי דגירה ב-30 °C.

הביופילם מציג ארכיטקטורה מורפולוגית מורכבת המעידה על תתי-אוכלוסיות תאים שונות המשתתפות בתהליך. לדוגמה, ייצור המטריקס החוץ-תאי והביופילם גורם להיווצרות קמטים על פני השטח של המושבה. איור זה מציג דוגמה להדמיה של דיפרנציאציה של תאים בזן מסומן בודד באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

זן זה נושא את המדווח הפלואורסצנטי Ptap, A CFP, המובטא בתת-אוכלוסייה של תאים המייצרים מטריקס וצבועים בכחול. תת-אוכלוסייה זו מייצרת ומפרישה את המטריקס החוץ-תאי המרכיב את הביופילם. התמונה הבאה היא תוצאה של הדמיה במיקרוסקופיה פלואורסצנטית של זן עם סימון כפול הנושא את המדווח Ptap, A CFP, ואת המדווח הנוסף P Surfactin YFP.

דיווח זה השני מאפשר ניטור של תת-אוכלוסיית התאים האחראית להפרשת מולקולת האיתות surfactin, המפעילה את רצף האיתות לדפרנציאציה של יצרני המטריצה. כאן, יצרני המטריצה צבועים בכחול (צבע מלאכותי), בעוד שיצרני ה-surfactant צבועים בצהוב (צבע מלאכותי), כתוצאה של ציטומטריה של זרימה דו-ממדית (2D flow cytometry) תוך שימוש בזן מסומן בודד הנושא את הדיווח ptap. כאן מוצג YFB.

זן הביקורת שלא טופל וללא גנים של חלבון פלואורסצנטי הראה אוכלוסייה יחידה עם פלואורסצנציה יחסית נמוכה בתאים הנושאי ptap. YFP תחת תנאים שאינם מעודדים ביופילם לא הבדיל את תת-האוכלוסייה של יצרני המטריקס, וכל האוכלוסייה הראתה גם היא פלואורסצנציה יחסית נמוכה. בניגוד לכך, תחת תנאים מעודדי ביופילם, זוהתה תת-אוכלוסייה של תאים בעלי פלואורסצנציה יחסית גבוהה ככתף מימין לפלואורסצנציה היחסית הנמוכה.

תוצאות השיא שהתקבלו מציטומטריה של זרימה בתלת-ממד מוצגות כאן. אותות פלואורסצנציה של הערוצים שננטרו מוצגים בציר X עבור YFP ובציר Y עבור CFP; הפאנל השמאלי העליון מראה זן ללא גנים של חלבון פלואורסצנטי כביקורת לפלואורסצנציה של הרקע. בפאנל הימני העליון, נעשה שימוש בזן מסומן בודד כדי לזהות את תת-האוכלוסייה של יצרני סורפקטין בערוץ הפלואורסצנציה של YFP, המסומן במסגרת צהובה.

בפאנל השמאלי התחתון, נעשה שימוש בזן מסומן בודד אחר כדי לזהות את תת-האוכלוסייה של יצרני המטריקס. בערוץ הפלורסצנציה של CFP המסוגר בכחול, מנוטרות תתי-האוכלוסיות של יצרני המטריקס ויצרני הסורפקטנט באמצעות הזן המסומן כפולה, והתוצאות מוצגות בפאנל הימני התחתון זה.

זוהו שתי תתי-אוכלוסיות של תאים המבטאים רמות גבוהות של השומנים הפלואורסצנטיים. כל אוכלוסייה ממוסגרת, מה שמראה כי אין חפיפה בביטוי השומנים בין שתי תתי-האוכלוסיות של התאים המתמחים. איור סופי זה מציג את הכימות של תתי-האוכלוסיות של יצרי המטריקס והקניבלים באמצעות ציטומטריה של זרימה בתלת-ממד.

בפאנל הימני העליון, נעשה שימוש בזן מסומן בודד כדי לזהות את תת-האוכלוסייה של ה"קניבלים". בערוץ הפלואורסצנציה של YFP המסוגר במסגרת צהובה, תת-אוכלוסייה זו של קניבלים תוארה ככזו המבדילה באופן מתואם את תת-האוכלוסייה של יצרי המטריקס. בפאנל השמאלי התחתון, תת-האוכלוסייה של יצרי המטריקס מזוהה בזן מסומן בודד אחר בערוץ הפלואורסצנציה של CFP.

במסגרת כחולה, התוצאות מהזן בעל הסימון הכפול בפאנל הימני התחתיו הראו תת-אוכלוסייה אחת של תאים פלואוריסצנטיים המבטאים הן YFP והן CFP במסגרת ירוקה. הביטוי הסימולטני של שני המדווחים מעיד על כך ששני מסלולי התמיינות התאים מופעלים באופן מתאם באותה תת-אוכלוסייה. לאחר צפייה בסרטון זה, אתם אמורים להחזיק בהבנה טובה של האופן שבו ניתן להדגים וכמותית את תתי-האוכלוסיות המובחנות של תאים המרכיבות ביופילם מיקרוביאלי, באמצעות אנליזה של אוכלוסיית התאים כגון מיקרוסקופיה פלואוריסצנטית או ציטומטריית זרימה.