מעקב אחר רדוקטיביים ו חמצוני חצאי תגובות של Monooxygenase פלבין תלויי באמצעות הופסק-Flow spectrophotometry

נוהל זה משתמש במכשיר stopped flow כדי לזהות את הצורות הספקטרליות השונות של SID A ולמדוד קצבים. התגובה המזורזת על ידי SID A ניתנת לחלוקה לתגובות מחציתיות של חיזור וחמצון של FAD. הפלבין המחוסן נקשר ל-N-A-D-P-H ומגיב ליצירת פלבין מושחז ו-NADP, בתוספת תגובה של חמצן מולקולרי וקישור של ornithine, המובילים ליצירת C ארבע.

הידרוקסי-פלאבין לאחר הידרוקסילציה של אורניטין, ההידרוקסי-פלאבין עובר דהידרטציה כדי ליצור את האנזים המחומצן. NA DP plus נשאר קשור לאורך כל המחזור הקטליטי והוא הסובסטרט האחרון שמשתחרר. מכשיר ה-stopped flow מאפשר ערבוב מהיר של נפחים קטנים של מגיבים ומבצע רישום.

שינויים ספקטרליים לאורך זמן בספקטרופוטומטר מאפשרים למדוד את קצב ההיווצרות והפירוק של תגובה המזורזת על ידי אנזים, ובמיוחד של תוואים זמניים. שתי חברות מהמעבדה שלי, ריטה רובינסון ואנוויירו רומרו, ידגימו ניסויים אלה תוך שימוש בסט A של flavor mono oxygenase כמערכת מודל. שפכו 250 milliliters של 100 millimolar potassium phosphate buffer לתוך בקבוק בוכנר בנפח 500 milliliters המכיל מוט ערבוב.

אטמו את הבקבוק בעזרת פקק גומי, לאחר מכן הניחו אותו על פלטת ערבוב וחברו את הצינור הקצר של הבקבוק לקו שנקרה sch flank. בצעו ניקוי גזים (degassing) לבאפר תחת ואקום למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר עם ערבוב, ולאחר מכן שטפו בארגון. חזרו על הפעולה חמש פעמים.

לבסוף, שטפו את הבקבוק ב-Argonne למשך 10 שניות. נתקו את הבקבוק ממסעף הוואקום והניחו אותו בתוך תא הכפפות. המשיכו לבצע ערבוב נמרץ כאשר הבקבוק פתוח.

מלאו את מזרקי המאגר בתמיסות של 18.13 units per milliliter glucose oxidase ו-100 millimolar glucose. כעת, העבירו את שסתומי ההנעה למצב טעינה. מלאו את מזרקי ההנעה.

בשלב הבא, העבירו את שסתוף F למצב ההנעה. באמצעות תוכנת הבקרה pro data, לחצו על "empty the stop syringe", ולאחר מכן דחפו את הבופר ממזריק ההנעה F דרך מעגל הזרימה על ידי הרמה ידנית של בוכנת ההנעה המתאימה. המשיכו עם שלושת מזריקי ההנעה האחרים והמתינו לשיווי משקל למשך שעה אחת.

כעת מלאו מחדש את מזרקי המאגר וחזרו על שטיפת מערכת הזרימה העצורה. להכנת בופר רווי חמצן, בועבע את התמיסה עם 100% oxygen למשך שעה אחת תוך כדי ערבול.

לאחר מכן הוצא את המחט הקצרה מהבקיה והמתן 10 שניות. המשך בהוצאת המחט הארוכה והנח את הבקיה הסגורה לתוך תא הכפפות. עבור תמיסת ה-N-A-D-P-H.

הנח מבחנה מסוג einor בנפח 1.5 milliliter המכילה milligram אחד של N-A-D-P-H בתוך תא הכפפות. המס ב-300 microliters של באפר פוטסיום פוספט אנאירובי בריכוז 100 millimolar, pH 7.5.

הסר 30 µL כדי לקבוע את ריכוז ה-N-A-D-P-H. כדי להוציא חמצן ממלאי האנזים, העבר את התמיסה למבחנה של 25 mL הכוללת מכסה עם מגנט ערבוב, פקק ואטם אלומיניום. הנח על קרח.

חברו לקו של Schlenk, לאחר מכן בצעו דגזינג באמצעות ואקום למשך 20 דקות, ולאחריו שטיפה ב-argonne. לבסוף, שטפו את הבקרה ב-Argonne למשך 10 שניות ונתקו אותה מסבון הוואקום. הניחו את הבקרה על קרח בתוך תא הכפפות.

בחלון לוח הבקרה של תוכנת ה-pro data control, בחרו ב-photo diode array, ב-external trigger וב-logarithmic scale. כמו כן, הפעילו את תוכנת ה-pro data viewer והגדירו את הספריה לאחסון קבצי הנתונים.

כעת החליפו את התמיסה במזרקי המאגר C ו-F בבופר פוספט פוטסיום 100 millimolar אנאירובי ב-pH 7.5. סובבו את השסתומים C ו-F למצב ההנעה. לחצו על empty the stop syringe בתוכנת הבקרה pro data control.

לאחר מכן, דחפו את הבאפר משתי מזרקי ההנעה דרך מעגל הזרימה על ידי הרמה ידנית של בוכנת ההנעה המתאימה. חזרו על השטיפה עם מזרקי המאגר C ו-F שלוש פעמים נוספות. כדי להבטיח הסרה מלאה של glucose oxidase ממעגל הזרימה, לחצו על baseline בתוכנת ה-pro data control.

החליפו את התמיסה במזרק המאגר F בתמיסת האנזים. סובבו את השסתום של F למצב ההנעה (drive). לחצו על "empty the stop syringe" בתוכנת הבקרה pro data.

דחפו את תמיסת האנזים ממזרק ההנעה F דרך מעגל הזרימה על ידי הרמה ידנית של בוכנת ההנעה התואמת. חזרו לתוכנת בקרת הנתונים (pro data control software) כדי להגדיר את זמן הרכישה ל-60 שניות. ודאו ששני מזרקי ההנעה מלאים בתמיסות התואמות להם ושבוכנות ההנעה נמצאות במגע עם בוכנות מזרקי ההנעה.

סובב את שני השסתומים למצב ההנעה (drive) ולחץ על acquire בתוכנת הבקרה pro data כדי לבצע את ההנעה. רכוש נתונים ספקטרליים של הצורה המחושנת של האנזים בשלוש חזרות, תוך שימוש בערך ה-A 4 52 nanometer שהתקבל מההנעות. קבע את ריכוז האנזים לפני הערבוב והכן ארבעה מיליליטר של תמיסת N-A-D-P-H.

מלאו את מזרק מאגר המילוי C בתמיסת N-A-D-P-H המרוכזת פי 1.5, ורוקנו ומלאו מחדש את מזרק העצירה שלוש פעמים כפי שהודגם קודם לכן. כעת, רכשו ספקטרומים במהלך רדוקציית האנזים תוך שטיפת התכנים ממעגל הזרימה באמצעות בופר פוטסיום פוספט אנאירובי 100 millimolar pH 7.5. כעת לחצו על baseline בתוכנת הבקרה pro data.

לאחר מכן, ערבבו 200 µL של תמיסת מלאי האנזים עם 1000 µL של בופר פוספיהט פוטסיום אנאירובי בריכוז 100 mM, pH 7.5. החליפו את התמיסה במזרק המאגר A בתמיסת האנזים.

העבירו את שסתום A למצב הנעה (drive) בתוכנת הבקרה של pro data. לחצו על stop syringe empty. דחפו את תמיסת האנזים ממזרקת הנעה A דרך מעגל הזרימה על ידי הרמה ידנית של בוכנת ההנעה המתאימה.

הגדירו את זמן ההשהיה ל-0.5 seconds ואת זמן הרכישה ל-60 seconds. ודאו שכל מזרקי ההנעה מלאים בתמיסות המתאימות להם ושבוכנות ההנעה נמצאות במגע עם בוכנות מזרקי ההנעה. לאחר מכן, העבירו את כל שסתומי ההנעה למצב הנעה ולחצו על acquire בתוכנת הבקרה pro data control.

השיגו נתונים ספקטרליים של הצורה המחומצנת של האנזים בשלישייה. לאחר מכן, החליפו את התמיסה במזרק המאגר B בתמיסת N-A-D-P-H בריכוז הגבוה פי 1.5 מתמיסת האנזים שבמזרק A. העבירו את שסתום B למצב ההנעה (drive) ורוקנו ומלאו מחדש את מזרק העצירה שלוש פעמים, כפי שהודגם קודם לכן בחלון לוח הבקרה.

הגדירו את זמן ההשהיה ל-0.5 שניות. בנקודת רכישה של 20 שניות, החליפו את התמיסה במזרק המאגר בבופר מחומצן. סובבו את שסתום C למצב ההנעה.

בצעו שטיפה של שלוש פעמים בתוכנת הבקרה pro data. הגדירו את זמן ההשהיה ל-15 שניות ואת זמן הרכישה ל-900 שניות. המשיכו לרכוש ספקטרה במהלך החמצון החוזר של האנזים המחוזר באופן מלא במכשיר ה-stopped flow.

ניתן לנטר את החיזור האנאירובי של SID A עם N-A-D-P-H על ידי מדידת שינויים במצב החמצון-חיזור של הפלבין באמצעות בליעה ב-452 nm. שינויים ספקטרליים נרשמים לאורך זמן, מה-SID A המחומצן ועד לספקטרום האחרון של SID A מחוזר באופן מלא. ניתן לקבוע את הקצב של שלב אנזימטי זה על ידי התאמת הנתונים למשוואה המתאימה. ניתן לקבוע את קצב החמצון ואת תוצרי הביניים של התגובה באמצעות מצב ערבוב כפול של stopped flow בתגובה זו על ידי AF Sid A. תוצר הביניים C four A Hydroxi flavin מזוהה בבירור עם lambda max של 380 nm, ולאנזים המחומצן יש lambda max של 450 nm.

לאחר השליטה בטכניקה, ניתן להשלימה בארבע עד שש שעות אם היא מבוצעת כראוי. זכרו לוודא שהתמיסות הן אנאירוביות. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי הדרך לחקור הן את הייון היחסי והן את הייון העלקיטיבי של FLA, כשלב מקדים לניסויים המשכיים כמו כימיה מהירה.

Quentin יכול לסייע להבהיר את טבעם העצוב של תוצרי הביניים.