Cytometry המוני: פרוטוקול לכוונון יומי ודגימות תאים פועלים על Cytometer המוני CyTOF

מטרתו הכוללת של פרוצדורה זו היא להדגים את הכיול היומי הנכון ואת ניתוח הדגימות במכשיר CyTOF. ראשית, המכשיר מורכב ומופעל. לאחר מכן, הגדרות המכשיר מותאמות (optimized) לצורך כיול להשגת אות מקסימלי.

כעת המכונה מוכנה להרצת הדגימות. בשלב הסופי, המכונה מנוקה ומכובה. בסופו של דבר, ניתן להשיג נתוני תאים אופטימליים בהתאם לדרישות זמן ספציפיות.

הדגמה ויזואלית של טכניקה זו היא קריטית. קשה ללמוד את נהלי ההקמה, הכיול והניקוי היומיים מתוך המדריך, כיוון שהם כוללים מספר שלבים תוכנתיים המבוצעים בו-זמנית.

עליכם לרכוש ניסיון כדי להבין את רמות הרקע ועצמות האות המתאימות. לפחות 15 דקות לפני תחילת הניסוי, פתחו את תוכנת ה-CyTOF ובחרו ב-instrument setup. לאחר מכן, בלשונית card cage, לחצו על כפתור ה-heater כדי לאפשר למעטפת תא הריסוס להגיע ל-200 °C.

החליפו את המזרק במזרק חשמלי במזרק חדש מלא במי milli cube. לאחר מכן, נקו את הנבולייזר על ידי שטיפה לאחור עם 5% Citron פעמיים דרך כל פתח. כדי להסיר שאריות Citron, חזרו על השטיפה לאחור עם מי Milli Q.

בשלב הבא, פתחו את שסתום מיכל גז הארגון, פעולה שתוביל להדלקת נורית הארגון בחזית המכשיר. לאחר מכן, חברו את הנבולייזר לכניסת גז המילוי (makeup gas) ואת הנבולייזר לצינור הזרקת הנוזל. הכניסו את קצה הנבולייזר לפתח הלבן במעטפת החימום בלשונית בקר ה-RFG בחלון הגדרות המכשיר.

לחצו על start plasma, ולאחר מכן לחצו על okay. לאחר סיום ההפעלה, לחצו שוב על okay בחלון הקופץ. כעת הדליקו את משאבת המזרקים.

בעת מילוי חוזר של המזרק, לחצו על כפתור העצירה (stop) במקום על כפתור ההשהיה (pause) כדי לאפס את מונה הנפח. לפני כיול הציטומטר המסתי (mass cytometer), ודאו שהמכשיר חומם במשך 20 דקות. לאחר שהמכונה התייצבה, לחצו על כפתור הגדרות הרכישה (acquisition settings) כדי לפתוח את חלון הגדרות רכישת הנתונים. בלשונית האנליטים (analytes).

לחצו על הטבלה המחזורית כדי לפתוח את פאנל בחירת האיזוטופים. לאחר מכן, בחרו את האיזוטופים המופיעים בתמיסת הכיול של DVS sciences המפורטת במדריך ולחצו על שמירה. לאחר מכן, לחצו על כפתור isotopes per reading כדי לפתוח את חלון המסות לכל קריאה.

בחרו את מספר הפולסים ושנו את קנה מידה של ציר ה-y על ידי הזנת מספר חדש ולחיצה על enter. כעת מלאו מזרק הזרקה נורמלי של 1 mL בצבע ירוק עם תמיסת כיוון. סובבו את בורר יציאת הדגימה למצב load.

הזרק 450 microliters של תמיסת כיול (tuning solution), ולאחר מכן סבב את הבורר למצב הזרקה. המתן עד שאיזוטופי תמיסת הכיול יתחילו להופיע כפסים בתצוגה זו. האותות באזור זמן המעוף (time of flight) שבין 9, 400 ל-9, 800 נובעים מאיזוטופי xenon בגז argon.

כעת חזרו למסות לכל חלון קריאה ולחצו על כפתור ההפעלה (play) הירוק. כל קו צבעוני מייצג איזוטופים שנבחרו מלשונית האנליטים. כאשר רמות האיזוטופים יהיו יציבות, כוונו את הזרם הנבחר (current select) מהתפריט הנפתח בלשונית הפרמטרים של חלון הגדרות רכישת הנתונים.

בחלון ההתחלה, הזן 0 עבור סיום (finish), והזן 10. עבור ערך הצעד (step value), הזן 0.5, ועבור זמן התייצבות (settling time), הזן 200. לאחר מכן לחץ על שמירה (save).

לאחר מכן, לחצו שוב על חלון המסיות לכל קריאה (masses per reading) ולחצו על play. לאחר סימון נקודות השיא של אותות האיזוטופים, עברו ללשונית הגדרות ערוץ ה-DAC בחלון הגדרות המכשיר. גללו למטה אל current והזינו את ערך השיא של האיזוטופ.

לחצו על set actual current value, ולאחר מכן שמרו (save). כעת, שנו את התפריט הנפתח ל-make up gas. הזינו 0.55 בחלון ההתחלה (start), 0.95 בחלון הסיום (end), 0.05 בחלון ערך הצעד (step value) ו-200 בחלון זמן ההתייצבות (settling time).

לחצו על save. לאחר החזרה לחלון ה-masses per reading ולחיצה נוספת על play, ציר ה-x יציג כעת את ספיקת גז הפיצוי (makeup gas flow rate). שימו לב לערכים שבהם אותות האיזוטופים מגיעים לשיא, והבחינו בעלייה המהירה של אות ה-GD 1 55 לקראת הסוף.

לאחר מכן חזור ללשונית הגדרות ערוץ ה-DAC. גלול למטה לסעיף ה-makeup gas והזן את ערך שיא האיזוטופ החדש. לחץ על set actual current value.

לאחר מכן לחצו שוב על save כדי לתעד את היחס בין האיזוטופ הרצוי לתחמוצת. ראשית, בצעו הזרקה שנייה של 450 µL של תמיסת כיול. לאחר מכן, בלשונית הפרמטרים, בחרו time מהתפריט הנפתח והזינו 0 בחלון ההתחלה (start), 10 בחלון הסיום (end), 1 בחלון ערך הצעד (step) ו-200 בחלון הייצוב (settling).

לאחר לחיצה על play בחלון המשאות לכל קריאה, השתמשו בסמן כדי לקרוא את הערך הגבוה יותר עבור TM 1 69 או TB 1 59, וכן את ערך ה-GD 1 55. כעת, הזרים שלושה מיליליטרים של Milli Q water דרך לולאת הדגימה, ולאחריהם 500 microliters של תמיסת שטיפה DVS. בלשונית כיול המסה, לחצו על run כדי לעקוב אחר התקדמות שטיפת הניקוי עד שעוצמת הפסים תתחיל לרדת.

לאחר מכן, הוסיפו שלושה מיליליטרים של מים ב-milli cube ועקבו עד שרמות הפסים ירדו לרמות הרקע. התחילו בהזנת האיזוטופים של הדגימה שהודגמו זה עתה במקום האיזוטופים של תמיסת הכוונון, ולאחר מכן לחצו על שמירה. בשלב הבא, פתחו את חלון הרכישה ושנו את הגדרות הרכישה כפי שנדרש עבור נפח הדגימה.

לדוגמה, דגימה של 450 µL תמלא את לולאת הדגימה ותדרוש 600 שניות להרצה כדי לאפשר השהיות ברכישת נתוני התאים. הגדירו את השהיית הרכישה ללפחות 30 שניות ואת השהיית יציבות הגלאי ללפחות 20 שניות לפני ההרצה. שטפו את דגימות התאים לפחות פעמיים עם מי milli cube, ולאחר מכן השעיו את הדגימה בריכוז מקסימלי של 10⁶ תאים למיליליטר וסננו את תמיסת התאים שהתקבלה דרך מסננת תאים של 35 µm.

כדי להסיר אגרגטים. כעת הזן שם קובץ חדש עבור הדגימה הנוכחית. שים לב שכל הקבצים חייבים להישמר בכונן E.

לאחר מכן, העבירו את שסתום לולאת הדגימה למצב טעינה (load), הזריקו את הדגימה, החזירו את שסתום לולאת הדגימה למצב הזרקה (inject), ואז לחצו על run. בחלון הרכישה, התאים ייוצגו בחלון הצילום (snapshot) כאוספים אופקיים של סימנים בכל תעלה איזוטופית אנכית, ויציגו את הרזולוציה המיטבית בטווח של 300 עד 500 תאים לשנייה, כפי שמוצג כאן.

עם סיום רכישת הנתונים של הדגימה, יופיע חלון קופץ. לחצו על אישור כדי לאשר את סיום הרצת הדגימה, ולאחר מכן הגדילו לפחות 500 µL של MQ water בין כל דגימה כדי לסייע בצמצום שאריות דגימה ולניקוי המכשיר. לאחר השימוש, הגדילו 450 µL של תמיסת שטיפה לתוך לולאת הדגימה. עקבו אחר שחרור המתכת החופשית ולאחר מכן שטפו את לולאת הדגימה עם 3 mL של milli Q water, תוך ניטור השטיפה עד להגעה לרמות רקע של פסים (background streak levels).

כדי לכבות את המכשיר, בחרו בלשונית בקר ה-RFG בחלון הגדרות המכשיר ולחצו על stop plasma. עם השלמת הפרוצדורה, לחצו על okay בחלון הקופץ, הממליץ להסיר את הנבולייזר תחת לשונית card cage. כבו את המחמם, סגרו את השסתום באספקת ה-argon, ולאחר מכן משכו בזהירות את הנבולייזר לאחור כדי להוציאו מתא התמריס.

בשלב הבא, שחררו את הברגה של צינור הכנסת הדגימה והניחו אותו בצד. שחררו את חיבור הכנסת גז המייק-אפ עד שיתרופה מעט, ולאחר מכן משכו החוצה את הנבולייזר. לבסוף, באמצעות אותה מזרק וצינור כפי שהודגם קודם לכן, נקו את שני הפתחים של הנבולייזר בעזרת 5%Citron ואחסנו את הנבולייזר כשהוא מכוסה ב-5%Citron עד לשימוש הבא.

שטיפה נאותה של הציטומטר המסתי (mass cytometer) במים מסוג UE ובתמיסת שטיפה DVS תפחית את רמות ספיגת המתכות אל הצינורות ולחלקים אחרים של המכשיר, ובכך תסייע להפחית רעשי רקע כפי שניתן לראות בגרפים אלו. כוונון שגוי, המיוצג על ידי הקו המגנטה, הגביר באופן משמעותי את היווצרות התחמוצות ב-m פלוס 16 בהשוואה לדגימה מכוונת כהלכה, כפי שמוצג על ידי הקו הכחול הכהה. לכך יש השפעה של הפחתה קלה של האותים הרצויים ב-m והגברה משמעותית של הפרעות הרקע הבלתי רצויות ב-m פלוס 16.

שטיפה נכונה ודילול תקין של הדגימות במים מזוקקים מסוג Milli Q יבטיחו רקע מינימלי ורזולוציה מרבית של תאים, תוך איזון מול הצורך במהירות. בדומה לנתונים מניסוי מייצג המוצגים כאן, בניסוי זה הועברו חרוזי פוליסטירן המכילים שפע טבעי של lanthanum 1 39 ODIUM one 40, TERBIUM 1 59, DIUM 1 69 ו-LUTETIUM 1 75 במצב רכישת תאים. הנתונים נותחו באמצעות FlowJo, ושרידי חרוזים שבורים הוצאו מהניתוח באמצעות gating.

נקבע כי הדגימה המכווןנת כראוי נמצאת בקצב זרימה של 0.74 liters per minute, כפי שמוצג על ידי הקו הכחול הכהה. בקצב זרימה זה נצפו עומקי אות גבוהים יותר מאשר בקצבי זרימה נמוכים יותר, ונצפה כי לדגימה המכווןנת כראוי יש אות גבוה יותר במסות המתכת M ואות נמוך יותר במסות התחמוצת m plus 16 בהשוואה לאותות שאינם מכווןנים כראוי. תצוגה מקרוב של האות במסה M של LANTHANUM 1 39 ו-THULIUM 1 69 מוצגת כאן.

שימו לב כי קצב זרימת גז הפיצוי משפיע על עוצמת האות של LANTHANUM 1 39 יותר מאשר על עוצמת האות של thulium 1 69. גרפים אלו מראים את האות במסות תחסן של m פלוס 16, כלומר 1 55 ו-180 5, המתאימות לתחסני LANTHANUM 1 39 פלוס oh 16 ו-thulium 1 69 פלוס oh 16 בהתאמה. שימו לב כי קצב זרימת גז הפיצוי מגביר את האות במסה 1 55 הרבה יותר מאשר את האות במסה 180 5, מכיוון ש-lanthanum 1 39 מתחמצן בקלות רבה יותר מאשר thulium 1 69.

עוצמות האות של m ו-m פלוס 16 כפונקציה של קצב זרימת גז הפיצוי מוצגות כאן. הסמלים המלאים מייצגים את MASS M, בעוד שהסמלים הפתוחים מייצגים את mass M פלוס 16; צבעי הקווים תואמים ל-mass M הרלוונטי. שימו לב כי עוצמות האות של LANTHANUM 1 39 ו-price ODIUM 1 41 מושפעות מאוד מקצב זרימת גז הפיצוי, ואפילו מגיעות לנקודה שבה נוכחות התחמוצת של mass m פלוס 16 גבוהה מזו של mass M. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה כיצד להפעיל את ה-CyTOF, לכוון אותו כראוי, להריץ את הדגימות שלכם, ולבסוף לנקות ולכבות את המכשיר בצורה נכונה בסיום ההרצות היומיות.