פלואורסצנטי, מיקרוסקופ הקרנת ואת הדור הבא הרצף: כלים שימושיים לזיהוי גנים המעורבים אברון Integrity

מטרת ניסוי זה היא לזהות את הגן או הגנים האחראים לשמירה על השלמות המורפולוגית והתפקודית של אברוני תא בצמחים. דבר זה מושג תחילה על ידי הוספה של Ethel methane sulfonate כחומר כימי למתן מוטגנים לזרעים הנושאים סמן פלואורסצנטי של האברונים. השלב השני הוא איסוף זרעים מצמחים בודדים מהדור המוטגני הראשון, כדי לגדל שושלות של דור המוטנטים הבא, M two.

בשלב הבא, בוחנים את זרעי ה-Eliana המוטגנים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי או פלואורסצנטי כדי לזהות פנוטיפ אורגנלי חריג. השלב הסופי הוא יצירת הדור המוטגני השלישי ואישור נוכחותו של הפנוטיפ המוטנטי. בסופו של דבר, ניתן למפות את המוטציה הרססיבית באמצעות כלי ריצוף מהדור הבא (next generation sequencing).

ברגע שמיקומו של הגן המוטנטי מזוהה, טרנספורמציה באמצעות הגן מסוג הבר (wild type) אמורה לשקם את הפנוטיפ האורגנלי השגוי. שיטה זו יכולה לסייע במתן מענה לשאלות מפתח בנוגע לשמירה על השלמות המורפולוגית והתפקודית של אורגנלות בצמחים. טיפול בסולפונטים של אתיל-מתאן בזרעים של atop sta משרה שינויים של דה-אמינציה של ציטוזין בגנום, מה שמוביל להפיכת ציטוזין לאורציל.

הוספת מוטציות. טיפול ב-EMS הוא שלב מרכזי בפרוטוקול זה כדי להבטיח יחס מוטציות מושלם בתוך שני פרטים של דור M2. כדי להתחיל, השג זרעים של Arabidopsis מסוג wild type Columbia Ecotype שהונדסו מראש כך שישאו סמן פלואורסצנטי רלוונטי לאברון.

העבר 0.8 גרם או כ-40,000 זרעים למבחנת פלקון בנפח 50 מיליליטר. לאחר מכן, הוסף 25 מיליליטר של מים מזוקקים ו-0.2% Ethel methane sulfonate. הדגר את התערובת למשך 16 שעות במערבל מוטציות במהירות נמוכה; לאחר ההדגרה, שאב את הנוזל והשלך אותו לבקבוק המכיל sodium hydroxide בריכוז one molar.

כדי לנטרל את ה-EMS, הוסיפו 25 milliliters של מים למבחנה מסוג Falcon המכילה את הזרעים. סגרו את המבחנה והפכו אותה חמש פעמים כדי לשטוף את הזרעים. לאחר שכל הזרעים שקעו, שאבו את המים והשליכ תם לבקבוק המכיל sodium hydroxide בריכוז one molar.

חזור על שלב שטיפה זה עד 10 פעמים; לאחר השטיפה האחרונה, השאר את הזרעים בכמות מינימלית של מים. המשך לעיקר הסטריליזציה של הזרעים על ידי הוספת 25 milliliters של bleach בריכוז 10% ונער בעוצמה למשך 30 שניות. ברגע שהזרעים שוקעים לתחתית, שפוך את ה-bleach ושטוף עם 25 milliliters של מים סטריליים.

לאחר הסרת המים הסטריליים, יש להוסיף 25 milliliters של 70%ethanol. יש לנער את המבחנות למשך 30 שניות ולאפשר לזרעים לשקוע לתחתית. יש לשפוך את ה-ethanol ולשטוף עם 25 milliliters של מים סטריליים.

חזרו על השטיפה במים סטריליים פעמיים. לאחר מכן, שפכו את הזרעים אל תוך צלחת פטרי מפלסטיק המכילה נייר סינון בעובי שלושה מ"מ. הניחו לזרעים להתייבש תחת המנדף לאחר דגירה של הזרעים למשך יומיים בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.

הניחו את הזרעים בצלחת פטרי של 150 מילימטר, בכמות של כ-250 עד 300 זרעים לצלחת, בתוך מצע Magi and scoog חצוי המכיל fighter gel כחומר ג'לטינציה. גדלו את הזרעים מדור M1 על צלחות למשך שבועיים. השתילו את השתיליים לאדמה ואפשרו לצמחים להמשיך לגדול.

לאחר 30 עד 45 ימים, הצמחים יגיעו לשלב הבגרות שבו ניתן יהיה לראות את הדליפות בבירור. בנקודה זו, אספו שני זרעים מצמחים M1 בודדים כדי להפיק 1000 שורות M2 עצמאיות. על מנת לבחון את השתילים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי או פלואורסצנציה, גדלו 60 זרעים מכל שורת M2 למשך שבעה עד 10 ימים בצלחות פטרי מפלסטיק בחצי.

במדיה מסוג Moreish ו-scoog המכילה fighter gel, גדלו גם חמישה נבטים של ביקרת השליטה שלא טופלו ב-EMS על אותה צלחת. לאחר גדילת הנבטים, הצמידו חמישה עד 10 cos lead-ins כאשר צד ה-ABAC seal פונה לעדשת ה-40x על תגית מיקרוסקופ וכסו בכיסוי זכוכית. תחת פלואורסצנציה, בחנו כל olein מהאזור הקורטיקלי לאזור המדיאלי כדי לזהות שינוי בהפצה התת-תאית של סמן האורגנלה. לאחר השתלת הצמחים החיוביים בקרקע וגידול הנבטים כפי שתיארנו, ודאו כי הפנוטיפ המוטנטי קיים בדור M3.

הסר את מוטציות הרקע המזהמות באמצעותB back crossing לפחות שלוש פעמים לגנום מסוג wild type המכיל את הסמן הפלורסצנטי האורגנלי הרצוי, כפי שמתואר בפרוטוקול הכתוב. כדי להתחיל במיפוי, השתמש בערכת cogen DN Easy Z plant mini kit כדי למצות כ-three micrograms של DNA גנומי מ-M three, המייצגת את ה-DNA של המוטנט ההומוזיגוט Columbia. שלח DNA זה לריצוף ב-Illumina genome analyzer two 14.

השלב הבא הוא להכליא את מוטנט ה-zago מסוג Colombia עם Las Berger כדי להפיק דור ראשון באמצעות הגבייה עצמית, שבו השילוב יכול להתרחש. דור ה-f2 שיווצר ישמש בסופו של דבר כאוכלוסיית מיפוי המכילה את הגן המדובר, הגורם למוטציה. על ידי השוואת ה-DNA הגנומי של אוכלוסייה זו עם ה-DNA הגנומי של צמחים מסוג wild type, ניתן לזהות את מיקום המוטציה בגנום.

לאחר גדילת צמחי ה-F2, אספו בין 70 ל-100 פרטי F2 המראים את הפנוטיפ השגוי ומספר זהה של צמחי F2 עם פנוטיפ מסוג בר (wild type); אספו דיסקיות עלה מכל צמח באמצעות מחורר נייר. יש לאסוף את דיסקיות העלה מעלים בעלי גיל זהה. כדי להבטיח כמויות דומות של DNA, ניתן לעבד את הדגימות לצורך מיצוי גנומי באופן נפרד או בקבוצות.

במקרה זה, ניתן לאסוף חמישה עד 10 דגימות עבור כל מבחנת eend orph, כך שיהיו פחות מבחנות מהן יש להפיק DNA גנומי. השתמש בערכה לטיהור DNA מעלי צמחים master pure כדי להפיק את ה-DNA הגנומי. ניתן להשיג כימות של ה-DNA הגנומי שהופק מכל דגימה באמצעות NanoDrop.

לאחר מכן, שלבו כמות שווה של DNA מכל דגימה עד לסך של 300 nanograms, תוך שמירה על הפרדה בין דגימות המוטנט לסוג הפרא (wild type) לצורך ביצוע תגובת הסימון תחילה; הוסיפו 60 µL של תמיסת random primer בריכוז 2.5 x ו-42 µL של מים. לאחר דנטורציה של ה-DNA בטמפרטורה הגבוהה מ-95 °C למשך חמש עד 10 דקות, קבעו את הדגימות על קרח כדי להשלים את דנטורציית ה-DNA. הוסיפו 15 µL של 10 X DN tps.

ערבבו עם biotin DCTP והשלימו לשלושה µL של polymerase. הדגירו את הדגימות למשך לילה בטמפרטורה של 25 °C.

ביום למחרת, הוסיפו 15 µL של sodium acetate בריכוז 3 M ו-400 µL של 100% Ethanol קר. דגרו את הדגימות המעורבבות בטמפרטורה של 80°C- למשך שעה, ולאחר מכן בצעו סנטריפוגה במהירות של 20,500 ×g למשך 15 דקות. שטפו את המשקע ב-500 µL של 75% ethanol קר לאחר סבב סנטריפוגה שני.

ייבשו את משקעי ה-DNA בטמפרטורה של 37 °C למשך 10 דקות. השביו את המשקעים ב-100 µL של מים והשתמשו ב-5 µL לבדיקת התנובה והאיכות באמצעות ג'ל אגרוז. תגובות סימון אקראי ראשוניות הועמסו על ג'ל אגרוז בריכוז 1% מתוך מאגר של צמחי F2 מסוג בר ומתוך מאגר של צמחי F2 מוטנטים.

כשלב סופי, העבירו 95 µL של תגובת הסימון של סוג הבר (wild type) והמוטנט עבור הכלאת מערך הגנום של gene chip arabidopsis ath one. לאחר סריקת ה-eraser, קובצי ה-dot CL שהתקבלו מנותחים באמצעות התוכנה שלנו. לאחר התקנת התוכנה, פתחו את התוכנית והדביקו את מחרוזת ה-bioconductor המופיעה בנוהל הכתוב.

לאחר מכן לחצו על מקש ה-Enter, שיבצע התקנה של חבילות BIOCONDUCTOR הסטנדרטיות מאתר ה-array, genotyping and mapping. הורידו וחלצו את הקבצים המפורטים בטקסט לתיקייה חדשה בשולחן העבודה. שמרו את הנתונים שהתקבלו מניסוי השבב הגנטי עבור wild type C, L ו-mutant C. כעת העתיקו את נתוני השבב הגנטי עבור wild type C ו-mutant C אל התיקייה.

בשלב הבא, פתחו את R במחשב PC. לחצו על file ולאחר מכן על change directory. בחרו את התיקייה המכילה את הקבצים, לחצו על file load workspace, ולאחר מכן בחרו ב-A one V five R data open read C do R באמצעות notepad והעתיקו את כל הטקסט ל-R. עבור מחשב Mac, לחצו על mis ולאחר מכן על change working directory.

בחרו את התיקייה המכילה את הקבצים. לחצו על workspace load workspace file ובחרו ב-ATH one V five R data. באופן דומה, פתחו את SFP R ואת MAP R באמצעות text, edit והעתיקו את הטקסט אל R בחלון ה-console.

תוצג הודעה לחיפוש גנים במאגר המידע של Arabidopsis או TAIR. העתיקו והדביקו את הקישור המופיע בטקסט בדפדפן האינטרנט. ייפתח חלון שיבקש לפתוח או לשמור את הקובץ.

בחרו בשמור. בחרו שם לקובץ והוסיפו את הסיומת. בצעו x ls.

לאחר מכן לחצו על שמירה (save). מוצגת כאן תוצאה טיפוסית צפויה. לאחר ניתוח הנתונים שהתקבלו ממערך גנום Arabidopsis H one, איור זה מייצג דוגמה למיפוי של מוטציית Columbia zero באמצעות שבב גנים של Arabidopsis, היברידיזציה של גנום H one, כאשר הפסים האופקיים מייצגים את ספי הגילוי.

המוטציה בדוגמה זו ממוקמת על כרומוזום 1, ומוגדרת באמצעות קווים אנכיים. פתחו את הקובץ dot XLS כדי למצוא את הקואורדינטה של המוטנט בתוך האזור הממופה. בקריאות ה-Illumina המורכבות של גנום המוטנט, זהו מעברים (transitions) ספציפיים של EMS בקרב פולימורפיזמי הנוקלאוטיד הבודד (SNPs).

לאחר השליטה בגישה, ניתן להשתמש בפרוטוקול המתואר זה למיפוי גנים בפרק זמן קצר יותר בהשוואה לשיטת המיפוי הקלאסית.