13 בפברואר 2013
אנו מדגימים כיצד להשתמש בטכניקת RNAi ההאכלה להפיל גני המטרה ופנוטיפ גודל גוף בניקוד ג elegans. שיטה זו יכולה לשמש עבור מסך בקנה מידה גדול כדי לזהות רכיבי פוטנציאל גנטי של עניין, כגון אלה מעורבים בויסות משקל גוף על ידי איתות DBL-1/TGF-β.
סרטון זה מדגים הליך לזיהוי גנים המווסתים את הצמיחה ואת גודל הגוף של תולעי C. elegans. באמצעות השתקת RNA (או RNAi) להשבתה של גנים מועמדים, מכינים תחילה צלחות המכילות חיידקים המבטאים RNA דו-גדילי המכוון לגנים הרלוונטיים. הרמפרודיטים בשלב הזחלי הרביעי מועברים לצלחות ה-RNAi.
ברגע שהם מגיעים לשלב הבגרות הצעירה, הם מועברים לצלחות RNAI חדשות להטלת ביצים. לאחר מספר שעות, הם מוסרים מהצלחות, ובכך נשארים אוכלוסיות מסונכרנות של עוברים. בשלב הפיתוח הרצוי, צאצאיהם נאספים ומוצמדים לשקף.
לבסוף, נרכשות תמונות מיקרוסקופיות של התולעים. ניתוח התמונה מדגים שינויים בגודל הגוף הנגרמים כתוצאה מהשבתה של גנים. למרות שניתן להשתמש בשיטה זו כדי לזהות רגולטורים של נתיב השסוגנל של TGF beta, ניתן ליישמה גם על נתיבים אחרים המווסתים התפתחות פוסט-עוברית ב-C. elegans, כגון נתיב השסוגנל של האינסולין.
התחילו את הפרוצדורה על ידי שיבוט רצפי הגנים המטרה לתוך הווקטור L 4 4 4 0 A, פלסמיד RNAi נפוץ לתולעים; העבירו את הפלסמיד הרקומביננטי למאבקי החיידקים HT one 15 DE three. זרעו את החיידקים שעברו טרנספורמציה על צלחות LB agar עם 25 micrograms per milliliter של carbonic ו-12.5 micrograms per milliliter של Tetracycline, ולאחר מכן בחרו קלון בודד לשימוש עתידי.
במקביל, העבירו את הווקטור הריק L 4 4 4 0 אל תוך זן החיידקים HT one 15. כדי להשתמש בהם כביקורת לניסויי התרבית, גדלו את החיידקים שעברו טרנספורמציה במיליליטר אחד של מצע LB עם 100 µg/mL של אמפיסילין למשך לילה בטמפרטורה של 37 °C.
אין להוסיף Tetracycline מכיוון שהוא מפחית את יעילות ה-RNAI. הוסף חמישה מיליליטרים נוספים של מרק LB עם 100 micrograms per milliliter של ampicillin לתרבית הלילית, ולאחר מכן דגירה למשך ארבע עד שש שעות נוספות בטמפרטורה של 37 °C. ברגע שהתרבית מוכנה, זרע 0.5 milliliters של חיידקי ניסוי או ביקורת על פלטות תולעי RNAI המסומנות בשם הכלון המתאים.
יש להכין לפחות שתי פלטות עבור כל תנאי. דגרו את הפלטות למשך לילה ב-37 degrees Celsius. למחרת.
יש להכין תרבית דשא של חיידקים המבטאים RNAi עם או ללא רצף הגן המטרה. בעלי החיים ישתמשו בחיידקים כמקור מזון. לאחר שצלחות ההאכלה ב-RNAI מוכנות, עקרו את קצה תיל פלטינה באמצעות להבה.
לאחר מכן, השתמשו בחוט פלטינה כדי להעביר שש עד עשר תולעי C. elegans הרמפרודיטיות בשלב לרווה הרביעי (L4) לכל צלחת RNAi. הניחו להרמפרודיטים לגדול בטמפרטורה של 20 °C למשך לילה. למחרת, בעלי החיים יהיו בוגרים צעירים.
העבירו אותם לצלחת RNAI חדשה, ערוכה ומסומנת כראוי. דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 20 °C למשך ארבע עד שש שעות כדי לאפשר לבוגרים להטיל ביצים. לאחר הדגירה, הסירו את כל הבוגרים מהצלחת כדי לסנכרן את הדור הבא.
לאחר הסרת הפרטים הבוגרים, התחילו את ספירת הזמן. זהו זמן אפס. דגרו את הפלטות בטמפרטורה של 20 °C כדי לאפשר לבעלי החיים לצמוח לשלב ההתפתחותי הרלוונטי.
כאן ייבחרו בוגרים צעירים לצורך אנליזה פנוטיפית. עבור knockdown שמתפתח בקצב רגיל, נדרשת דגירה של 72 שעות. יש לשים לב שגנים שונים משפיעים על התפתחות בעלי החיים באופן שונה, ולכן ייתכן שיהיה צורך להתאים את זמני הדגירה.
אם ה-RNAi גורם לבעלי החיים לגדול בקצב שונה, ניתן לזהות בוגרים צעירים כאquלה שחלפו לא יותר מ-24 שעות מרגע השלב L4, עם התפתחות VUL מלאה ושני עד שישה עוברים ברחם, כפי שמוצג כאן. כדי לזהות שלבי התפתחות אחרים, על החוקר להשתמש בהתפתחות הגונדיה וה-VUL כמדריך. ברגע שבעלי החיים הגיעו לשלב המתאים, יש להיערך לדירוג הפנוטיפים של גודל הגוף של התולעים שעברו טיפול ב-RNAi.
כעת הניחו שתי שכבות של סרט סימון צבעוני על זכוכית של תיתמיר בעובי מילימטר אחד, כפי שמוצג כאן. הכינו שתי זכוכיתות כאלה. לאחר מכן, הניחו תיתמיר זכוכית חדש בין שתי הזכוכיתות עם הסרט והחילו טיפה של 2%Agros המומס במים.
לחץ שקף זכוכית שני מעל מרכזו של שקף זכוכית חדש כדי ליצור פד agarose דק. לאחר שה-agarose התגבש, הסר את השקף העליון. השקף עם פד ה-agarose מוכן כעת להעמסת תולעים.
סמנו את הזריקה בשם השבט. הוסיפו 10 µL של sodium azide בריכוז 25 mM למסדית ה-aros. לאחר מכן, בעזרת תיל פלטינה כפי שנעשה קודם לכן, העבירו 30 עד 40 בעלי חיים אל תוך תמיסת ה-sodium azide.
כדי לקבע אותם, הנחו זכוכית כיסוי בחלק העליון. בצעו זאת הן עבור בעלי החיים הרקומביננטיים והן עבור בעלי החיים הנושאיים L 4 4 4 0 ריקים שטופלו ב-RNAi. לאחר מכן, הניחו את שקופית המיקרומטר תחת מיקרוסקופ הדיסקציה עם עדשה אובייקטיבית של 2.5x.
באמצעות Q Capture או תוכנה דומה, צלמו תמונה של סרגל המיקרומטר ושמרו אותה. לאחר מכן, הניחו את התולעים תחת המיקרוסקופ וצלמו תמונות. כדי למדוד תחילה את אורך הגוף, פתחו את התמונה של סרגל המיקרומטר בתוכנת Image Pro.
לאחר מכן לחצו על measure ובחרו ב-calibration. לאחר מכן בחרו ב-spatial Calibration wizard כאשר האפשרות calibrate the active image מסומנת. לחצו על next.
הזינו את השם עבור הכיול וודאו שיחידות הייחוס המרחביות מוגדרות למיקרונים. לאחר מכן, סמנו את הכפתור Create a reference calibration ולחצו על Next. לחצו על draw reference line.
סרגל קנה מידה לייחוס יופיע. מקם מחדש את סרגל קנה המידה כך שיתאים לקצוות המיקרומטר. לאחר מכן, ציין כי הייחוס מייצג 1000 יחידות.
לחצו על אישור (okay). לאחר מכן על הבא (next) ועל סיום (finish). לאחר כיול התוכנה, פתחו תמונת תולעת.
לאחר מכן, תחת תפריט measure, בחרו ב-calibration, ואז לחצו על select spatial. בתפריט הנפתח, בחרו בשם הקובץ שנוצר עבור כיול המיקרומטר. לאחר מכן, תחת תפריט measure, בחרו ב-measurements בחלון שנפתח.
בחר את כלי השרטוט החופשי (free draw) והשתמש בעכבר המחשב כדי לשרטט קו העובר דרך מרכז גוף בעל החיים, מהראש ועד הזנב. האורך יופיע בחלון. חזור על תהליך זה עבור כל בעלי החיים בשטח.
ייצא את מדידות האורך לקובץ Microsoft Excel או לתוכנה סטטיסטית מתאימה אחרת. נתח את הנתונים על ידי חישוב הממוצע וסטיית התקן עבור כל דגימה. לאחר מכן, השווה את התוצאות עבור כל קבוצה באמצעות מבחן t של student.
חלבון DBL one ממשפחת ה-TGF beta (transforming growth factor beta) נחוץ להפעלה של מסלול ה-TGF beta. בתגובה להפעלת אות, משדרים תוך-תאיים מסוג smad עוברים אל הגרעין ומתחילים בשעתוק גנים. ניתן לראות כי באלו שבהם מסלול ה-TGF beta הופסקה פעולתו, גודל הגוף קטן יותר, כולל אורך גוף קצר יותר בהשוואה לבעלי חיים מסוג wild type.
לפיכך, בוצעו סריקות ב-C. elegans. מוטציות בגודל הגוף מאפשרות זיהוי של רכיבים ומשנים במסלול השירות של TGF beta כדי לבחון את יעילות ה-RNAi באמצעות האכלה לזיהוי מוטציות בגודל הגוף. נעשה שימוש ב-RNAi כדי להשתיק רכיבים במסלול DBL one, SMA three ו-SMA six בארבעה זנים שונים של C. elegans.
זני ה-C elegance שנבדקו כללו שניים בעלי רגישות גבוהה ל-RN AI: A one, Lin 15 B, ו-RF three, כמו כן את זן הפרא הסטנדרטי N two ואת זן ה-LIN 36, שרגישות ה-RNAi שלו דומה לזו של N two כפי שמוצג כאן. כאשר הביטוי של SMA three או SMA six הופר, בעלי החיים הראו גודל גוף קטן משמעותית בהשוואה לבעלי החיים בבקרה, למעט במקרה של SMA six RNAi ב-Lin 36. רקע ב-RF three.
אורכי הגוף של בוגרים צעירים ברקע גנטי רגיל לאחר טיפול ב-RNAi היו 84 עד 95% מאלו של הווקטור לבדו. ברקע גנטי של A one Lin 15 B, אורכי הגוף של בוגרים צעירים לאחר RNAi היו 68 עד 86% מהחיות בביקורת. עם זאת, זן ה-A one lin 15 B מייצר פחות צאצאים.
דבר זה הופך אותם לבלתי מתאימים לסריקות רחבות היקף. לכן, מומלץ להשתמש בזן RF three עבור טכניקות אלו. לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה לגבי האופן שבו ניתן לזהות גנים המווסתים צמיחה וגודל גוף באמצעות טכניקת RNI interference.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סרטון זה מדגים נוהל לשימוש בהשתקה של RNA (RNAi) לזיהוי גנים המסדירים צמיחה וגודל גוף ב-C. elegans. השיטה מאפשרת סינון בקנה מידה גדול כדי לחשוף מרכיבים גנטיים המעורבים בוויסות גודל הגוף דרך איתות DBL-1/TGF-β.
This RNAi feeding strategy enables scalable, cost-effective screening for genes regulating body size in C. elegans, supporting target validation in developmental pathways. By linking phenotypic readouts to TGF-β signaling, it provides mechanistic de-risking for early discovery programs focused on growth regulation. The method’s reproducibility and minimal equipment needs make it suitable for academic-industrial collaboration in preclinical target identification.
The method fits within early discovery to lead identification, where genetic hits are prioritized for pathway validation and mechanistic follow-up.