סינתזה קומבינטורית של שחרור חלבון ותפוקה גבוהה מסרט הפולימר וספריות Nanoparticle

סרטון זה מתאר סינתזה קומבינטורית של ספריות ננו-חלקיקים וסרטי פולי-אנהידריד מתכלים, וכן זיהוי בסבירה גבוהה של שחרור חלבונים מספריות אלו. ראשית, נעשה שימוש במכשור השקעה אוטומטי בעל סבירה גבוהה להשקעת מערך מגוון של מונומרים לתוך קובטות זכוכית. תגובת פולי-קונדנסציה מבוצעת בטמפרטורה של 180 °C ובלחץ של 0.3 tor למשך 1.5 שעות.

תנאי תגובה אלה ספציפיים עבור סינתזת פולימר פולי-אנהידריד מסוג C-P-H-S-A. באמצעות מכשיר השקיעה האוטומטי, הממס וכל רכיבי הכמיסה משוקעים לתוך הקיווטות המכילות את ספריית הפולימרים. ניתן להשתמש בסוניקציה כדי להבטיח המסה מלאה של הפולימר ופיזור אחיד של הרכיבים הנוספים.

לאחר מכן, הפולימר המומס מועבר למבחנה המכילה ממס שאינו הממס המקורי (nonsolvent) כדי לייצר את ספריית הננו-חלקיקים באמצעות שיקוע ננוי (nanoprecipitation). הננו-חלקיקים מופקים באמצעות ייבוש בוואקום או סינון, ולאחר מכן מועברים לפלטה של 96 בארות המותאמת לשחרור חומרים. לבסוף, הספרייה הטעונה בחלבון מדגרה בתנאים פיזיולוגיים, וקינטיקת שחרור החלבון מוערכת באמצעות שיטת זיהוי פלואורסצנטית במרחב.

בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות קינטיקה של שחרור חלבון כפונקציה של תכונות הפולימר או תנאי סביבת השחרור. היתרון המרכזי של גישה זו על פני טכניקות קונבנציונליות אחרות של בדיקת דגימה אחת בכל פעם הוא היכולת לסנתז מספר דגימות בו-זמנית. לאחר מכן, ניתן לסנן דגימות אלה בסריקה רב-דגימתית (high throughput) כדי לבחון אינטראקציות בין חלבון לפולימר, תא לפולימר או פולימר למארח.

פעולה זו מאיצה את התכנון והפיתוח הרציונליים של ביו-חומרים אלו עבור הולכת תרופות והנדסת רקמות. את הפרוצדורה תדגים La Tricia Peterson, פוסט-דוקטורנטית מהמעבדה שלי. בחלק זה של הסרטון, נעשה שימוש במכשיר השקעה ברמה גבוהה (high throughput) להשקעת ספריית מונומרים בעלת הרכב משתנה, לאחר סינתזת הפולימר.

מכשיר זה משמש לייצור של ספרייה קומבינטורית של סרטי פולימר או ננו-חלקיקים, ריקים או טעונים בחלבון. הפלטפורמה האוטומטית מורכבת משתי משאבות מזרקים ניתנות לתכנות ושלושה מפעילים ליניאריים המחוברים בטור למחשב. תוכנת LabVIEW משמשת להעברת פקודות למשאבות המזרקים ולמפעילים.

מזרקים של 10 cc בעלי אטימה גבוהה נטענים למשאבות מזרקים עם צינורות קפילריים ממתכת המחוברים באמצעות מחברי lure lock, אשר מזרימים את תמיסות הפולימר לתוך קיובטות זכוכית. בהדגמה זו, יעשה שימוש ב-seic acid או SA יחד עם one six Biss para oxy heane או CPH כדי ליצור ספריית ננו-חלקיקים המכמיסים Texas Red Boan serum albumin. ניתן להתאיים את ההוראות בסרטון זה ובמסמכים הנלווים כדי לייצר ולבחון מגוון רחב של ספריות סרטי פולימר וננו-חלקיקים.

כדי לסנתז את הספריות, התחילו בהמסה של כל מונומר וכלורופורם בריכוז סופי של 25 milligrams per milliliter בתוך מבחנה מזכוכית. לאחר מכן, העבירו כל תמיסה למזרק אטום לגז בנפח 10 cc על ידי שאיבת התמיסה דרך קצה ה-lure lock של המזרק. הסירו בועות אוויר כלשהן.

בשלב הבא, חברו את צינור הנימי מפלדת אל-חלד עם חיבור lure lock העמיד בממס לקצה המזרק. אחרו את הצינורות הנימיים בתפסנים וחברו אותם למעמד טבעת. לאחר מכן, מקמו את קצותיהם של שני הצינורות הנימיים בתוך כלי ההתחלה.

עבור השקעת המונומר. מקמו את המזרקים על משאבות המזרקים הניתנות לתכנות ונעלו אותם במיקומם בתוכנת ה-lab view. הגדירו את המפעילים הליניאריים למצב ההתחלה בתוכנה.

התחל את השקיעה האוטומטית של המonomers SA ו-CPH אל תוך הקובטות הזכוכית בצירים x, y ו-Z. המפעילים (actuators) ימקמו נכונה את צינורות הנימיים בכל קובטה וישאבו נפחים מתוכננים של כל מונומר לתוכם, ובכך ייצרו ספריית מונומרים בעלת הרכבים משתנים. לאחר שקיעת המונומרים.

העבירו את ספריית המונומרים לתנור ואקום שחומם מראש והדרימו בטמפרטורה של 180 degrees Celsius ובלחץ של 0.3 tour למשך 1.5 שעות כדי לאפשר פולימריזציית עיבוי. לאחר ההדגרה, הושלמה בניית ספריית הפולימרים. לאחר מכן, ייוצרו ננו-חלקיקי פולימר טעונים בחלבון.

עיינו בפרוטוקול הנלווה להכנת ספריית סרטי פולימר טעונים בחלבון לצורך הכנת ספריית ננו-חלקיקים טעונים בחלבון. במקרה זה, הוסיפו את החלבון, Texas red bovine serum albumin, לממס המתאים, שצריך להיות מסוגל להמיס את ספריית הפולימר. כאן, נעשה שימוש ב-methylene chloride בריכוז של 2 mg/mL.

מלאו מזרק של 10 cc בממס המכיל Texas Red BSA והניחו אותו במשאבת המזרקים הראשונה. לאחר מכן, הניחו מזרק נקי וריק של שני cc במשאבת המזרקים השנייה, והניחו מבחנות המכילות 15 milliliters של ממס שאינו ממיס, במקרה זה פנטן, במחזיק המבחנות הסמוך לפלטפורמת הבקבוקונים. לאחר מכן, בתוכנת lab view, הפעילו את תהליך שיקוע הממס האוטומטי על ידי בחירת התוכנית.

לאחר הפעלת התוכנית, הממס מוזרם אל תוך הקובטות המכילות את ספריית הפולימרים, מה שיוצר ריכוז פולימר של 20 mg/mL. כאשר כל הממס הוזרם, יש להמתין דקה אחת עד חמש דקות להמסת הפולימר. לאחר מכן, ניתן לבצע ערבוב אופציונלי כדי להבטיח המסה מלאה של הפולימר ופיזור אחיד של החלבון.

בשלב הבא, הפעילו את תוכנית העברת הדגימות ב-LabVIEW. כל דגימה של פולימר מומס בספרייה נשאבת למזרק הריק ומועברה לשפופרת המתאימה של הממס הלא-ממיס במחזיק הדגימות. לאחר העברת כל דגימה, השגיחו את הננו-חלקיקים הטעונים בחלבון על ידי הנחת ספריית הננו-חלקיקים בתא ריקומון בוואקום של 10 millimeters of mercury, או באמצעות סינון בוואקום עד להסרת הממס.

כדי לחקור את השחרור של BSA encapsulated, התחילו עם פלטת פוליפרופילן עמוקה בעלת 96 בארות, ששופרה על ידי הסרת חצי האינץ' העליון של דופן כל בארה בכל עמודה שנייה סמוכה בפלטה. הסרת החלק העליון של כל בארה בין עמודות A ו-B, C ו-D, E ו-F, ו-G ו-H מאפשרת זרימת נוזלים בין כל זוג בארות סמוכות כאשר הן מלאות עד לנפח העברה מלא. הוסיפו סטנדרטים של Texas red BSA בטווח של 1000 עד 10 micrograms per milliliter אל הפלטה העמוקה בעלת 96 הבארות.

אלו ישמשו לחישוב כמות החלבון ויחשבו גם את כיבוי הפלואורוכרום; השחזר את המסה הרצויה של הננוחלקיקים בבופר PBS, ולאחר מכן בצע סוניקציה כדי לפזר את החלקיקים באופן אחיד. לאחר מכן, העבר את ספריית הננוחלקיקים לתוך פלטת 96 בארות עמוקה והמתן עד שהדגימות ישקעו לתחתית הפלטה. לאחר מכן, באמצעות פיפטור, מלא באיטיות את כל הבארות הסמוכות בבופר PBS עד לגובה של רבע אינץ' מהחלק העליון של הבאר.

יש להוסיף מספיק בופר לבארים הסמוכות כך שיהיה זרימה חופשית בין הבארים. לאחר מכן, אטמו את לוח השחרור בעזרת המכסה והניחו אותו בטמפרטורה של 37 °C תחת ערבוב. לאורך הניסוי, בנקודות זמן הדרגתיות, השתמשו בסורק פלואורסצנטי שטוח מדגם 9, 400 Typhoon כדי לסרוק את הלוח תוך שימוש במסנני עירור, לייזר ופליטה מתאימים.

לאחר הסריקה, השתמשו בתוכנה לכימות תמונות כדי לכמת את כמות החלבון המצומד לפלואורוכרום ששוחרר בכל שלב שחרור. Texas Red BSA הוכנס לתוך ספריית ננו-חלקיקים פולימריים שסונתזו ממונומרים של SA ו-CPH כפי שמתואר בסרטון זה, כדי לקבוע את קינטיקת שחרור החלבון כפונקציה של הכימיה של הפולימר. הננו-חלקיקים הטעונים בחלבון הודגרו בטמפרטורה של 37 °C למשך חודש, ובמהלכו בוצעו סריקות פלואורסצנטיות בנקודות זמן הדרגתיות לצורך כימות שחרור החלבון.

כפי שמוצג כאן, שיטת תפוקת ההידרו זו שימשה לקביעת קינטיקת השחרור של Texas Red BSA מספריית ננו-חלקיקי פולי-אנהידריד A-C-P-H-S-A. נצפו מגמות התלויות בכימיה, עם שיעורי שחרור עולים מכימיות של סרטי Sarich. תוצאות דומות התקבלו בעת שימוש בבדיקות סטנדרטיות לכמות חלבון.

בניסוי נפרד, נבחנה שחרור של Texas Red BSA מספריות סרטים של CPT CPH Poly Anhydride כפי שמוצג כאן; נצפתה קינטיקת שחרור מסדר אפס כמעט, כאשר סרטים עשירים ב-cpeg שחררו את החלבון במהירות הרב ביותר, עם יישומים פוטנציאליים בתחום הרפואי כהתקני הולכת תרופות מתכלים. תוצאות אלו מצביעות על כך שניתן לשלוט בפרופיל השחרור הרצוי של תרופה טיפולית או אנטיגן של חיסון על ידי שינוי הכימיה של הפולימר. בעקבות הליך זה, פותחו שיטות קומבינטוריות אחרות לבחינת תחומים כגון יציבות חלבונים, רעילות תאית, אקטיבציה תאית ופיזור ביולוגי InVivo.

היבטים אלו חשובים לתכנון רציונלי של ביו-חומרים להולכת תרופות ולהנדסת רקמות. אין לשכוח להשתמש בציוד מגן אישי (PPE) מתאים ולהקפיד על נהלי מעבדה בטיחותיים לאורך כל הפרוטוקול.