קצב העברת נתונים גבוה תא יחיד ו מרובה תאים מיקרו אנקפסולציה

יישומים המשתמשים בתאים העטופים בטיפות קטנות בגודל פיקוליטר היו מוגבלים לעיתים קרובות בשל חוסר היכולת לשלוט במספר התאים בכל טיפה. פרוטוקול זה מדגים שיטה לשליטה על כליאת תאים על ידי שילוב של שתי תופעות מיקרופלואידיות מובחנות: סידור תאים דינמי-נוזלי ויצירת טיפות בנחיר מיקרופלוואידי במיקוד זרימה (flow focusing micro nozzle). בתעלה שמעלה, מסופקת קצב זרימה גבוה מספיק של תמיסה מימית עם תאים או חלקיקים תלויים, כדי לגרום להיווצרות של שרשראות עם מרווחים שווים בכיוון הזרימה במורד הזרם.

דיזת יצירת טיפות במיקוד זרימה משמשת ליצירת טיפות מימיות בקצבי קילו-הרץ בתוך נוזל נשא של שמן מותר המיוצב על ידי סורפקטנט. רכבות של חלקיקים בתאים מסודרים משולבות לאחר מכן עם יצירת טיפות על ידי כוונון קצבי הזרימה של המים והשמן, כדי לספק קצבי יצירת טיפות המסונכרנים עם הגעתם של תאים או חלקיקים מסודרים לאורכם אל דיזת יצירת הטיפות, כאשר נעשה שימוש בחלקיקים כתחליפים לתאים. כדי להדגים פרוטוקול זה, קצבי הזרימה חייבים להיות קטנים מספיק כדי להגביל את הנוזל.

מאמצי גזירה על תאים ביולוגיים, החפיפה בין יצירת טיפות סדירת התאים לבין חיוניות התאים. מגבלות קצב הזרימה של התמיסה המימית מספקות משטר תפעולי אידיאלי לכליאה מבוקרת של תאים בודדים ומספר תאים. ניתוח של נתוני מיקרוסקופיה וידאו מראה כי יעילויות כליאה של תא בודד או שני תאים, או חלקיקים, עולות על יעילויות כליאה אקראית ומפחיתות באופן משמעותי את מספר הטיפות שאינן מכילות את מספר התאים או החלקיקים הרצוי.

כליאה של תאים וטיפות מגבילה את הדילול של הפרשות התאים, מדגישה את ההטרוגניות התאית ושולטת גם באותות בין-תאיים בהשוואה לתמיה מאסיבית (bulk suspension). אמצעים יעילים לכליאת תאים אלו בתוך טיפות מספקים כלי בעל ערך עבור חוקרים ביולוגיים. כדי להתחיל בהליך זה, תכננו תבנית של מיקרו-ערוץ כפי שמוצג בדמות זו בתוכנת AutoCAD.

קטע התעלה הארוך מייצג את תעלת סידור הזרימה המימית ברוחב של 27 מיקרון. הסכימה המוגדלת של הדיזה מראה רוחב תעלה שווה של 27 מיקרון עבור תעלת הסידור המימית ועבור תעלת השמן, ואחריהן התכווצות של הדיזה ל-22 מיקרון והתרחבות פתאומית לתעלה רחבה יותר של 61 מיקרון. גובה ההתקן הוא 52 מיקרון.

הן כניסות התמיסות המימיות והן כניסות השמן כוללות מסנני פסולת גדולים עם מרווחים בסדר גודל של רוחב תעלת הסדירה, כפי שמוצג בסכימה מוגדלת זו של כניסת השמן. כאן מוצגת תמונה אמיתית של תעלת הסדירה והנחיר המוזרקים בצבע. השתמשו ביצרן חיצוני להדפסת מסכת שקיפות ברזולוציה גבוהה על סרט מיילר (Mylar) או קוורץ, שבה התעלות שקופות על רקע כהה.

בשלב הבא, צרו תבנית מאסטר מסיליקון ומפוטורזיסט SU-8 עבור יציקת שכפול (replica molding). הדביקו את תבנית המאסטר לתחתית של צלחת פטרי עבור יציקת שכפול של PDMS. לאחר השלמת יציקת השכפול וחיתוך קווי המתאר של ההתקן, השתמשו במנקב ביופסיה בעל קוטר חיצוני של 0.75 millimeter כדי ליצור פתחים זורמים בשלושת האזורים העגולים המוצגים באיור זה. הדביקו סרט הדבקה שקוף לצד התבנית של ה-PDMS וקלפו אותו כדי להסיר אבק לאחר קישור בפלזמה.

את ה-PDMS לשקף זכוכית נקי של מיקרוסקופ. הניחו את המכשיר כולו בתנור וחממו את התנור בהדרגה עד ל-120 °C. השאירו את המכשיר בתנור בטמפרטורה של 120 °C למשך הלילה כדי להשלים את ההדבקה ולהחזיר את ה-PDMS למצבו ההידרופובי המקורי.

שיטה חלופית להפיכת פני השטח הזכוכיתיים של התעלה להידרופוביים היא הזרקת ציפוי כגון aquae לתוך הפתחים הפלואידיים ולאחר מכן שטיפה באוויר. באמצעות מזרק של 1 mL ומחט למזרק, שאבו כמה מאות µL של אוויר, ולאחריהם כמות מזערית של aquil המספיקה למילוי קצה המזרק המתכתי בלבד. הזריקו בזהירות אך בנחישות את ה-aqua ולאחריו את אוויר השטיפה אל תוך הפתחים הפלואידיים, מבלי לשבור באגרסיביות את הקשר בין ה-PDMS לזכוכית.

חזרו על ניקוי האוויר בכל פתחי הכניסה והיציאה תוך ניגוב שאריות מים, כדי למנוע הצטברות משקעים שעלולים לסתום את התעלות לאחר הייבוש. בקרת ריכוז התאים חיונית להשגת מספר תאים מתאים עבור מספר הטיפות המתאים. תהליך זה כולל שני מרכיבים מאתגרים.

השלב הראשון הוא הערכת הריכוז המתאים מראש, והשני הוא שמירה על ריכוז זה במהלך הניסוי. עבור המכשיר הספציפי המשמש במחקר זה, תאים או חלקיקים בגודל של 8 עד 15 מיקרון צריכים להיות מספקים עבור כיסוי מבוקר. בהדגמה זו, מיקרוספירות של polys diary בגודל 9.9 מיקרון ישמשו כתחליפי תאים. כדי להכין את ריכוז תרחיף החלקיקים המימי להשגת כיסוי אופטימלי, התחילו עם ריכוז מלאי של מיקרוספירות של 1% solids לפי משקל, תוך שימוש בנתונים קודמים עבור סדר מלא. כהנחיה, הגבירו את הריכוז ל-1.5% solids על ידי צנטריפוגה עדינה של מיליליטר אחד מדגימת המלאי, הסרת 250 מיקרוליטר של נוזל על, וערבוב מחדש של החלקיקים באמצעות וורטקס או ערבוב עדין יותר.

בשימוש בתאים, הן לתאים והן לחלקיקי פוליסטירן יש משקל סגולי הגבוה מאחד, על אף שדבר זה אינו מוצג בסרטון זה. עבור ניסויים ארוכי טווח הנמשכים מספר דקות עד שעות, ניתן להתאים את כבידות התמיסה על ידי הוספת מומס כגון סידן כלורי עבור חלקיקים או opti prep עבור תאים. לאחר שהסספנסיית התאים או החלקיקים מוכנה, הכינו דגימה של 10 מיליליטר של פאזה רציפה של שמן פלואורו-פחמן באבוב צנטריפוגה של 15 מיליליטר וערבבו במכשיר וורטקס.

ערבבו את החומר הפעיל שטחית ואת שמן הפלואורופחמן עד לריכוז של כ-2.5% משקל למשקל. במקרה זה השגנו תערובת של 2.4% משקל למשקל, דבר המקובל להקמת ניסוי המיקרו-כמיסה. ראשית, הפעילו את אספקת החשמל עבור המיקרוסקופ האופטי ההפוך והמצלמה המהירה.

התמקד בשכבת המיקרו-ערוצים ובדוק את הערוצים לאיתור סתימות או שאריות שעלולות להשתחרר. בחר ערוץ הנקי משאריות גדולות או סתימות ניכרות. גזור שלושה קטעים של צינור PVC שקוף מסוג tigon עבור כניסת התמיסה המימית, כניסת השמן ויציאת האמולסיה, כדי למזער את הנפח המת.

חתוך אורך מספיק של צינורית כדי להגיע ממשאבות המזרקים אל המיקרוסקופ. חתוך את קצוות הצינורית בזווית של 45 מעלות. כדי להקל על ההחדרה לתוך פתחי הנוזלים, השתמש בפינצטה כדי להחדיר בלחץ את קצוות הצינורית לתוך פתחי הנוזלים. לאחר מכן, הדחף בלחץ מחט מזריק מפלדה אל חלל הצינורית בפתח החופשי של צינור כניסת התמיסה המימית, באמצעות מחט בעלת קצה קהה במידה 30 gauge.

חזור על הפעולה עבור צינור כניסת השמן. הזז את המכשיר וחבר את הצינורות לבמה של המיקרוסקופ תוך שימוש בעדשה אובייקטיבית בעלת הגדלה של 20 פעמים, וכוון את המיקוד לפיית המכשיר. כוונן ידנית את המיקרוסקופ להארה מסוג Kohler כדי לספק תאורה אופטימלית במישור המוקד.

באמצעות תוכנת מצלמת המהירות הגבוהה, חתכו את שטח הראייה סביב הדיזה כדי לאפשר קצבי פריימים גבוהים יותר, ולאחר מכן הגדירו את קצב הפריימים, זמן החשיפה והגדרות מצלמה אחרות כנדרש להקלטה אופטימלית. לאחר מכן, מלאו מזרק של 1 mL בתמיסת הפאזה המימית שהוכנה קודם לכן ועורבבה היטב. מלאו מזרק של 3 mL בתמיסת פאזת השמן.

הטה אחת ממזרקי המילוי לאנך והקש עליה כדי להעביר את בועות האוויר אל פיית המזרק. לחץ באיטיות על הבוכנה למשך זמן מספיק כדי לדחוף את האוויר אל קצה המזרק תוך החזקתו במצב אנכי. חבר את המזרק למחט המזרק המתאימה שכבר מחוברת למכשיר.

לחץ על הבוכנה כדי לדחוף את האוויר דרך הנפח המת של מחט המזרק, עד שהנוזל נדחף דרך הצינור כמעט עד למכשיר. התקן את המזרק באופן מאובטח למשאבת מזרקים וחבר את תפס הבוכנה. חזור על החיבורים עבור המזרק השני והתקנו למשאבת מזרקים שנייה. הפעל כל משאבת מזרקים ותכנת כל משאבה. בהתאם לפרוטוקולי היצרן, הגדר את קצבי הזרימה הראשוניים ל-50 microliters per minute עבור פאזת השמן ול-five microliters per minute.

בתחילת השלב של הפאזה המימית, המשאבות ממתינות עד שכל נוזל ייכנס למכשיר וימלא את התעלות תוך דחיפת שאריות האוויר. תהליך זה עשוי להימשך מספר דקות בשימוש בקצבי הזרימה הראשוניים. יש להתבונן בהיווצרות טיפות בדיזה.

העלה לאט את קצב הזרימה של התמיסה המימית כדי לצפות בסדר של החלקיקים בתעלה הארוכה של התמיסה המימית. עם העליית קצב הזרימה, אין להעלות אותו עד לנקודה שבה נגרם סילוף (jetting) של זרם הנוזל המימי בפיחית, כפי שמוצח בדוגמה זו; שים לב שבשימוש בפיחית שונה ליצירת טיפות, הזרימה אינה יציבה והטיפה אינה עקבית. אם ריכוז החלקיקים נמוך מדי כדי לספק רכבות לסירוגין עם מספר מועט יחסית של חלקיקים חסרים, והדגימה לא הותאמה לצפיפות (buoyancy matched), הטה פיזית את משאבת המזרק לכיוון פתח המזרק כדי לאפשר שקיעה הדרגתית של החלקיקים לעבר פתחי המזרק.

לאחר השגת סדר הטיפות הרצוי, התאימו את קצב זרימת השמן כדי לכייל את תדר היצירה ואת גודל הטיפות. התאימו את שני קצבי הזרימה באופן איטרטיבי כדי להשיג את שיעורי הכמיסה ונפחי הטיפות הרצויים. ברגע שהוכשבה כמיסה מסודרת ויציבה, העבירו את צינור היציאה ממכל הפסולת למכל איסוף לשימוש עתידי.

ניתן להשיג כימוס (encapsulation) של חלקיק או תא בודד או כפולי בנצילות גבוהה. שימוש בפרוטוקול זה מציג תוצאה מייצגת של כימוס חלקיק בודד עם קצב זרימה של שמן של 60 µL לדקה וקצב זרימה מימי של תשעה µL לדקה. למדא, מספר החלקיקים הממוצע לטיפה, הוא 0.95.

המרחק בין החלקיקים בכיוון הזרימה הוא כ-17 עד 18 מיקרונים עבור חלקיקים חלופים בעלי סדר מלא. קצב ייצור הטיפות בדוגמה זו הוא 6.1 קילו-הרץ עם גודל טיפה ממוצע של 24.4 פיקוליטרים. ההיסטוגרמה משווה את יעילות כליאת החלקיקים בטיפות עבור סדר של כליאת חלקיק בודד עם פלוס.

בכל הנוגע לסטטיסטיקה, עבור גודל מדגם של 517 טיפות, שיעור הכמוסה האקראית של טיפות המכילות חלקיק אחד הוא 79.5%, לעומת שיעור כמוסה אקראית חזוי של 36.7%. נמצא כי שיעור החלקיקים שהגיעו לטיפות שהכמיסו כהלכה היה 83.7% עבור גודל מדגם של 491 חלקיקים, בעוד ששיעור הכמוסה האקראית היה 37.3%. כמוסה של שני חלקיקים מושגת פשוט על ידי הפחתת קצב זרימת השמן ל-30 µL לדקה, תוך שמירה על קצב זרימת התמיסה המימית על 9 µL לדקה. במקרה זה, lambda, מספר החלקיקים הממוצע לטיפה, הוא 1.8, בדומה לכמוסה של חלקיק יחיד.

המרווח בין החלקיקים בכיוון הזרימה הוא כ-17 עד 18 מיקרון עבור חלקיקים לסיגומים מסודרים לחלוטין. לטיפות הגדולות יותר גודל ממוצע של 39.8 picoliters והן נוצרו בקצב של 3.8 kilohertz בהשוואה לכמיסה אקראית. עבור גודל מדגם של 383 טיפות, השבר הממוצע של טיפות כמיסה מסודרת המכילות שני חלקיקים הוא 71.5%, לעומת שבר כמיסה אקראית חזוי של 26.8%. השבר של החלקיקים שהגיעו לטיפות שנכמסו נכונה נצפה כ-79.5% עבור גודל מדגם של 689 חלקיקים, בעוד ששבר הכמיסה האקראית היה 33.4%.

יחד, תוצאות אלו מראות כי יעילויות הכליאה של חלקיק בודד ושל שני חלקיקים עולות על יעילויות הכליאה האקראית ביותר מפי שניים, ומפחיתות משמעותית את מספר הטיפות שאינן מכילות את מספר התאים או החלקיקים הרצוי. חשיבותן של ריכוזי חלקיקים או תאים נכונים להשגת יעילות כליאה גבוהה מודגמת בריצה ניסיונית זו. בעוד שקצבי הזרימה של השמן והמוהל זהים לאלו של ריצת הכליאה של שני חלקיקים שהוצגה קודם לכן, מספר התאים הממוצע לטיפה lambda הופחת ל-1.57.

כתוצאה מכך, סדר מלא אינו מתרחש, ולכן נוצרים חללים ברכבות המשאירים טיפות שמש מ conter עם פחות חלקיקים מהצפוי. היסטוגרמה זו מראה את הירידה ביעילות הכנסת שני חלקיקים עקב הערך הנמוך יותר של Lambda. עבור גודל מדגם של 324 טיפות, השבר הממוצע של טיפות המכילות שני חלקיקים היה 55.9%, כאשר מספר טיפות עם חלקיק בודד היה כמעט שווה למספר הטיפות עם שני חלקיקים.

דבר זה מצביע על כך ש-Lambda צריכה להיות שווה או קרובה למספר התאים הרצויים לטיפה כדי למקסם את כמות החלקיקים או התאים שנכללו בצורה נכונה, כאשר הערך המדויק של lambda נבחר בהתאם לשאלה אם מספר תאים נמוך יותר או גבוה יותר לטיפה הוא סובלני. בהדגמה זו, אנו מנצלים הבדלי ציפה כדי לאפשר בקרה בזמן אמת על הריכוז במהלך הניסוי. עם זאת, עבור ניסויים לטווח ארוך יותר, ייתכן ומומלץ לבצע התאמת ציפה כדי להשיג תוצאות עקביות יותר לאחר הכליאה של תאים לתוך טיפות מימיות.

ניתן לבצע ניסויים תלויי זמן בתוך מבחנה לצנטריפוגה או תחת מיקרוסקופ על ידי הזרקה חוזרת של הטיפות למערכים מיקרופלואידיים.